Способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ЛШЩОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, предусматривакищий последовательную, обработку биомассы при наг1:)евании ацетилхлоридом и метанолом при соотношении био масса-ацетилхлорид-метанол 100:

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЛЮС

РЕСПУБЛИК

«е «и

З1Щ С 12 1/ОО

OflHGAHHE HSOSPETEHNR jl3

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 Иь.. г-.,:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ВО ю (21) . 3526790/28-13 (22) 23. 12. 82 (46) 30.0»4.84» Вап. 11 16 (72) В.А.Султанович, А.П.Нечаев, Г»В.Колесник и И.В.Рождественская (71) Московский ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт пищевой проьыиленности (53) 663. 18 (088.8) (56) 1.Андреев Л.В., Склифас А.H.

О хемотаксономических аспектах обмена бактерий. Сборник "Виохивяя и биофизика микроорганизмов", Горький

ГГУ, 1977, с. 3.

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 968072, кл. С 12 Я 1/00, 1980. (54)(57) c1Iocos KoimmcTaEHHoro

ОПРЕДИБНИЯ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА

ЛИПИДОВ ИИКРООРГАНИЗИОВ, предусматривающий последовательнув. обработку . биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом при соотношении биомасса-ацетилхлорид-метанол 100:(50—

60):(180-220), удаление жидкой фазы, обработку сухого остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматаграфии, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения точности анализа, перед обработкой биомассы ацетилхлоридом ее подвергают обезвоживанию путем последовательного добавления ацетило . хлорида, нагревания при 50-52 С, добавления гептана н кипячения до удаления уксусной кислоты с последующим введением внутреннего стандарта и разделением реакционной смеси на две части, в одну из которых добав- Е

С2 ляют перманганат калия в количестве

5-10 мг на 100 ип сухой биомассы, при этом соотношение биомасса-ацетилхлорид-гептан составляет 1А:(4,3—

4,8)А:(8,2-8,6)А, где А — влажность р биомассы, X.

1089123

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов. 5

Известен способ количественного определения жирнокислотного состава липидов,микроорганизмов, предусматривающий обработку биомассы при нагревании с последующим анализом реакционной смеси методом газовой хроматографии j1j .

Обработку биомассы ведут методом сопирализа, согласно которому .биомассу обрабатывают раствором гидроокиси тетраметиламиония и нагревают при 120-140 С, полученную реакционо ную смесь подвергают пиролизу в испарителе хромафографа нагрео

Э том до 350 С. 20

Недостатком данного способа является отсутствие возможности количественного определения нолиненасыщенных жирных кислот, что ограничивает область применения способа определением жирнокислотного состава бактерий, которые такие кислоты не содержат.

Известен также способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов, предусматривающий последовательную обработку биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом, при соотношении биомасса-ацетил- 35 хлорид-метанол 100:(50-60):(180-220) удаление жидкой фазы, обработку сухого остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматографии (2) ., 40

Недостатком известного способа является невысокая точность анализа при определении содержания жирных кислот методом внутреннего стандар. та. 45

Цель изобретения — увеличение точности анализа.

1О

1

Указанная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения жирнокислотного сос- @ тава липидов микроорганизмов, предусматривающему последовательную обработку биомассы при нагревании ацетилхлоридом и метанолом при со отношении биомасса-ацетил-хлорид- и метанол 100!(50-60):(180-220), удаление жидкой фазы, обработку сухоro остатка гексаном и анализ гексановой вытяжки методом газовой хроматографии, перед обработкой биомассы ацетилхлоридом ее подвергают обезвоживанию путем последовательно го добавления ацетилхлорида нагреб

Э вания при 50-52, добавления гептана и кипячения до удаления уксусной кислоты с последующим введением внутреннего стандарта и разделением реакционной смеси на две части, в одну из которых добавляют перманганат калия в количестве

5-10 мг на 100 мг сухой биомассы, при этом соотношение биомасса-ацетилхлорид-гептан составляет 1А:(4,3—

4,8)А:(8,2-8,6)А, где А — влажность биомассы, X.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску влажных дрожжей обрабатывают ацетилхлоридом таким .образом, чтобы весовое соотношение влаги, содержащейся в образце, и ацетил . хлорида составляло 1:(4,3-4,8).

Реакционную смесь нагревают при

50-52 С, происходит реакция обраО зования уксусной кислоты и выделение НС6. После этого добавляют гептан в количестве, превышающем содержание влаги в образце в

8,2-8,6 раза. Реакционную массу нагревают при 92-95 С до удаления о уксусной кислоты в виде азеотропа с гептаном. После этого в сухой остаток добавляют внутренний стандарт (например, 0,2 мл 2,5X-ro раствора арахиновой кислоты) и, разделив пробу на две части, в одну добавляют 5-10 мг перманганата калия в расчете нв 100 мг сухой биомассы.

Обе пробы подвергают обработке ацетилхлоридом и метанолом таким офразом, чтобы соотношение сухая биомасса: ацеткпхлорнд:метанол составляло 100з(50-60):(180-220). Жидкую фазу упаривают на песчаной бане при 70-80 С. Сухой остаток в обеих о пробах экстрагируют гексаном и гексановые вытяжки подвергают анализу на хроматографе.

Нагревание влажной биомассы после внесения ацетилхлорида позволяет удалить влагу, содержащуюся в.образце, путем взаимодействия ее с ацетилхлоридом. Последний превращается в уксусную кислоту, которая. удаляется в виде азеотропа с гептаном. Удаление воды при помощи химической ре1089123

25 акции ускоряет процесс сушки образца и позволяет получить точные данные об абсолютном содержании жирных кислот в единице веса сухой биомассы. Деление образца после вне- 5 сения в него вну, еннего стандарта и обработка одной части образца перманганатом калия позволяет повы..ить точность анализа за счет обеспечения достоверной идентификации качественного состава жирных, кислот.

Установлено, что оптимальным количеством перманганата калия является 5-10 мг на 100 мг сухой биомассы, Пример 1. Анализируют состав 15 жирных кислот липидов хлебопекарных дрожжей, выращенных на отходах производства этилового спирта.

Влажность образца 65%. Влажность определяют в сушильном шкафу при 20

130 С доведением образца до посто о янного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мп помещают точную навеску влажных дрожжей (0,3 г). Для связывания воды добавляют 0,85 r ацетилхлорида (по отношению к воде

1:4 3) Колбочку с реакционной массой нагревают на песчаной бане при

50-52 С в течение 10 мин с воздуш-, о ным хблодильником в виде шарика. 30

После этого добавляют по 1,60 г гептана (по отношению к воде 1:8,2) и при нагревании на песчаной бане при 91-95ФС удаляли уксусную ки ту, выделившуюся при взаимодействии ацетилхлорида с влагой образца, в ниде аэеотропа с гептаном. После упаривания жидкой фазы в колбочку добавляют 0,2 мы внутреннего стандарта (2%-ный раствор

40 арахиновой кислоты в хлороформе), затем, разделив пробу на две части, . в одну добавляют 5 мг марганцевокислого калия. Содержимое обеих колбочек обрабатывают ацетилхлори- 41 дом (по 50 мг) и метанолом (по 2 5 мл).

Жидкую фазу упаривают при 70-80 С на песчаной бане 1 ч. После упаривания жидкой фазы образовавшиеся ме тиловые эфиры экстрагируют 0,2 мл 50 гексана и гексановую вытяжку вводят в хроматограф с пламенно-ионизационным детектором марки ЛХИ-SMg. Анализ проводят в остальных колонках длиной 2 м, внутренним диаметром 4 мм, заполненных твердым носителем хроматон Супер с 10% дизтиленгликольсукцинатом. Температура испарителя 220 С, температура термостата колонок 170 С. Газ носитель — гелий, расход через колонку 30 мл/мнн. Соотношение рас" ходов гаэ — носитель: водород:воздух — 1: 1: 10.

Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот рассчитывают методом внутреннего стандарта.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Количественное содержание кислот, определенное по предлагаемому способу, в образце влажной биомассы хорошо соответствует контрольному определению, а обработка части пробы КМп04 позволяет точно дифференцировать критические пары: С1 „и .С4&.q, С1&.4 н C19:0 С а.4 и C22:0

Для пика, соответствукнцего первой паре не обнаружено уменьшения его площади после обработки КМя04, что указывает на присутствие кислоты

С@.о. Для следующих двух критических пар уменьшение содержания вещества в пробе уменьшено, что означает наличие кислот С1& 4 и С2д;4.

Пример 2. Анализируют состав жирных кислот липидов хлебопекарных дрожжей, выращенных на мелассе (отходы сахарного производства).

Влажность образца 77%. Влажность эпределяют в сушильном шкафу при рысушивании влажного образца до постоянного веса. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают

0,45 r влажного образца. Для .связывания воды добавляют по 1,60 г ацетилхлорида. Колбочку с содержимым нагревают с воздушным холодильником на песчаной бане 10 мин при

50-52 С для полного связывания воды.

После охлаждения в колбочку добавляют

2,90 г гептана. Колбочку помещают в песчаную баню с температурой

91-95 С до полного удаления уко сусной кислоты. После этого в колбоЧку добавляют 0,2 мл внутреннего стандарта (2,5% раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и разделив про-. бу на две части, в одну из них дополнительно вносят 10 мг марганцевокислого калия. Содержимое обеих колбочек после этого обрабатывают ацетилхлоридом и метиловым спиртом в тех же количествах и условиях, что и в первом примере. Анализ метиловых

1089123 эфиров проводят на хроматографе с соблюдением тех же условий, что и в первом примере.

Полученные данные представлены в табл. 2. 5

Пример 3. Анализируют состав жирных кислот липидов дрожжей рода Candida, выращенных на этаноле. Влажность образца 42Х. В круглодонную колбочку объемом 5 мл помещают навеску 0,.15 г влажной биомассы, к которой добавляют расчетное количество ацетилхлорида (0,30 г).

Смесь выдерживают 10 мин на песчаной бане при 50-52 С с обратным воэр душным холодильником. После этого реакционную массу охлаждают и добавляют 0,54 г гептана. Для удаления образовавшейся уксусной кислоты смесь нагревают при 92-95 С до исО чезнования запаха уксусной кислоты.

После удаления уксусной кислоты в колбочку добавляют внутренний станТаблица 1

Содержание кислот (мг) в расчете на 1 г сухой биомассы

Содержание кислот (мг) в 1 r лиофилизированной биомассы (контроль по прототипу) Уточненнйй состав жирнокислотного спектра (определено по предлагаемому способу с обработкой пробы КИ 104) (определено в образце влажной биомассы по предлагаемому способу (0 1

<0,1

c„2:à

С(4:о (О,! (0,1

%0,1 (0,1 (0 1 с0,1 с0,1

С(4.о с0,1

0,13

0,12

<091

ci5:(с0 1

c0,1

cl5 0

3,48

С„.р

3,25

3,66

С16 р

16:(6,84

5,06

c0 ° 1

2,03

1,97

2,01

6,37

9,84 с

9,36

0,08

0,36

0,45

11редполагаемый состав жирнокислотного с. ектра (без дифференциации критических пар) дарт (2X.-ный раствор арахиновой кислоты в хлороформе) и, разделив пробу на две части, обрабатывают ацетилхлоридом (50 мг) и метанолом (2,5 мл), предварительно добавив в одну из них 7,5 мг КМяО ° После упаривания жидкой фазы полученные метиловые эфиры жирных кислот экстрагнруют гексаном (0,2 мл) и гексановую вытяж- ку вводят в хроматограф. Условия указаны в предыдущих примерах. Расчет полученных хроматограмм проводят методом внутреннего стандарта.

Полученные результаты представлены в табл. 3, Таким образом, предлагаемый способ количественного определения жпрнокислотного состава липидов микроорганизмов позволяет повысить точность анализа путем повышения достоверности идентификации отдельных компонентов жирнокислотного спектра.

1089123

Продолжение табл. 1

Содержание кислот (мг) в расчете на 1 кг сухой биомассы

Содержание кислот (мг) в г лиофилизированной биомассы (контроль по предлагаемому способу

Уточненный состав жирнокислотного спектра (определено по предлагаемому способу с обработкой пробы КИи04) 0,8

1,07

1,13

»п 2

18:5

0 26

0,13

Следы

0,29. 0,16

0,16

24,2

24,5

18,7

Я Насьпценных кислот

5,5

5,9

12,9

18,8

18,6

Содержание кислот (мг) в расчете на 1 г сухой биомассы

Уточненный состав жирнокислотного (определено по предлагаемому способу с обработкой.пробы КИп04) (определено в образце вл»пжной биомассы по предлагаемому способу спектра (О,! (0i1

С» 2.+

1,48

1,49

1,37

0,49

0,46

14:O

0,51

14! 0

0,37

0,32

0,39

СЕО

8,76

8,91

8,59

С»ь: о

С»Ь: 0

28,3

32, 01

32,91

4,6

С»8!о /С»6: 3

4,17

cfslо

4,55

Предлагаемый состав жирнокислотного спектра (без дифференциации критических пар) СЕ.

C»S:5 !О: 4 22;0

Е Всех кислот

Я Ненасьпценных кислот

Предлагаемый состав жирнокислотного спектра (без дифференциации критических пар) Содержание кислот (мг) в 1 r лиофилизированной биомассы (контроль по прототипу) (определено в образце влажной биомассы по предлагаемому способу

Таблица 2

1089123

,10

ПРодолжение. табл. 2 ванне ки ете на сы

30,7

42,0

42,9

С18; г

С18 2 /С 19 0

18. У

5,7

6,0

3,0

18;д

2,83

2,91

1,17

100,00

98,00

79,28

15,05

15 65

16,09

63, 19

84,35

82,95

Таблица 3 одериание кислот (мг) расчете на 1 «r сухой омассы

Уточненный состав нирНОКНСЛОТНОro спектра

1о:О

1о:o (0,1 (0,1

С41: о (0,1 (0,1

C„,„о

С1 : o

0,3

0,29

0,3

4,3

4,1

С14 О

4,2

С11 о

0,54

0,5

С15. о !

С1ь, О

0,5

15:о

97)0

96)5

95,1

С ;о

Йредполагаемь3й с Ос тав иириокислотного спектра (без дифференщиапии критических пар) Х Всех кислот Е Насыщенных киСлот

Е Ненасыщенных кислот

Предлагаемый состав лирнокислотного спектра (без дифференциации критических пар) СодеряиВиие

КИСЛОТ (IOt в 1 г лиофи ливировани биомассы (контроль

ПО НРОТО» типу}

Содериание кислот (мг) в 1 г лиофилизироваиной биомассы (контроль по предлагаемому способу еделено азце ой биоПО агае- . способу

1 пределе но образце ааиой биоCCM По едлагаему способу определено о Йредлага

ЕМОМУ СПОобу с обра откой проы РЬО ) УТОЧНЕННМЙ

СОСТЛВ ИИРНО"

КИСЛОТИОГО спектра

1089123

Продолкение табл. 3

1 I

Содериание кислот (мг) в расчете на 1 г сухой биомассы точиеннмй остав àþðÿîкислотного аектра

71 9

7l,2

72,3

С®.о

189,4

192,2

102, 2

33,05

13,0 i

31 8

2,63

2,8

2,76

С10;0

8,4

8,6

3,1

18:3

2,0

4 3

4,1

С(8 .4

3,21

3,2

3,3

Сп;0

Сйо;4

0,6

1,07

1,12

С д 4

2,17

3,01

3,1

301,51

422,47

416,77 всех кислот

178,85 г вась|ценных кислот

178,44

180,24

7 ненасьпценных кислот

237,92

123,07

242, 23

Составитель Т.Мелентьева

Редактор Н.Ковалева ТехредМ.Гергель Корректор С.Шекмар

Заказ 2871/23 Тираи 522 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Уигород, ул. Проектная, 4

Предлага евай состав иирнокислотного спектра (без дифференциации критических nay) Содериание кислот (мг) в l г лиофилизированной биомассы (контроль ао арототиау) (оаределено в образце влаииой биомассы ао аредиагаемому саособу оаределено о. аредлФ аемому сао обу с обре откой ар@

6аа КМн0 )