Способ определения полиаминов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАМИНОВ путем гомогенизации биологической ткани, данснлирования гомогената, экстрагирования дансилированных полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей , отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, хроматографию проводят в системе paci(- ворителей бенэол-триэтиламин в соотношении

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(50 С 01 N 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ

21 3435633/28-13. (22} 29.03.82 (46) 07.05.84. Бюл. В 17 (72) С.П. Сяткин и Т.Т. Береэов (71) Университет дружбы народов им. Патриса Пумумбы (53) 616.07(088.8) (56) 1. Bachrach U. - "Ital. J. Biochem", 1976, v 25, р. 77.

Sailer N., Aakar A. - "3,Chromatograf", 1971, v. 62. в. 121.

„. SU „„091069 (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИАИИН0В путем гомогениэации биологичес кой ткани, даисилирования гомогената, экстрагироваиия дансилированных полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей, о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что, с целью ускорения способа, хроматографию проводят в системе растворителей бенэол-триэтиламин в соотношении (5: 1)-(5,5! 1).

1 10910

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения полиаминов в тканях животных и человека.

Известен способ определения поли5

cLMHHoB и их Bpo09BQpHblx с помощью ферментативных реакций (1 3.

Известен также способ определения полиаминов с использованием флуоресцирующего реагента и последующей .хро- 1б матографией в тонком слое (23.

Недостатком известного способа является использование нескольких сложных растворителей, что значительно удлиняет время проведвния анализа. 15

Цель изобретения — ускорение способа.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу определения полиаминов путем гомогенизации биоло- гической ткани, дансилирования гомогената, экстрагирования дансилированных полиаминов с последующей тонкослойной хроматографией в системе растворителей хроматографию проводят в системе растворителей бензол-триэтиламин в соотношении (5: 1)-(5,5:1).

Способ. осуществляют следующим обра эом.

Для анализа используют ЗЗХ-ный свежеприготовленный гомогенат печени (соотношение массы и объема 1:2).

Ткань гомогенизируют в 0,05 мМ фосфатном буфере рН 7,2, содержащем

О, 1 ммоль/л дитиотреитола ("Serve", ФРГ) и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфата ("Reanal", Венгрия). Все манипуля-, ции с тканью проводят на холоде при

2 40С.

Экстрагирование полиаминов проводят равным объемом 0,2 М НС10,1.. Пробы 40 центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. К О, 1 мл супернатанта добавляют О, 3 мл раствора дансилхлорида ("Schuchardt", ФРГ) в ацетоне (4 мг/мл) и Ь мг Ба СО 10 Н О. Пробы инкубируют 18-20 ч в темноте при комнатной температуре. Продукты реакции экстрагируют 0,5 мл бенэола, Органический слой .переносят в коническую центрифужную пробирку и оставляют выпари- 50 ваться на ночь при комнатной температуре в темноте.

Осадок растворяют в 20 мкл бенэола и наносят на пластинки ручного и пррмышленного изготовления ("Ka- 55

valier", Чехословакия). Суспенэию готовят с двойным количеством воды из расчета 28 г сухого силикагеля

69 2 марки ЛС 5/40 ("Chemapol" Чехословакия) на 1 см поверхности. Связывающим веществом является гипс (5-15 )

Пластины высыхают эа ночь при комнатной температуре. Активирование проводят при 110 С в течение 30 мин.

На остывшую пластину наносят одновременно до .10 проб на расстоянии 2 см от нижнего и боковых краев. Готовые пластины "Silufol UV-254" с подломкой из алюминиевой фольги в качестве сорбента имеют широкопористый силикагель по Петри с люминесцентным индикатором. Связывающим веществом служит крахмал.

Одномерную хроматографию проводят двукратно в системе бензол-тризтиламин в соотношении 5: 1-51591 в течение 45 мин. Дансилпроизводные аминокислот и гидролизованный реактив остаются на линии -старта. Избыток дансилхлорида не мешает идентификации пятен. Пятна дансилполиаминов обнаруживают по желто-зеленому свечению в ультрафиолетовом свете. Идентификацию пятен фракций полиаминов проводят с помощью свидетелей — препаратов солянокислых производных путресцина, спермидина и спермина ("Sewa", ФРГ) .

Интенсивность флоуресценцин измеряют прямым сканированием пятен на автоматизированном микроскопе-анализаторе ПРОТВА-С. Для регистрации интенсивности излучаемого света используют интерференционный светофильтр

Ô4-6 с длиной волны в максимуме пропускания jl =488 ммк,шириной пропускания в середине максимума Д = 10 ммк и коэффициентом пропускания Т„ с=

= 22X. Напряжение ФЭУ равно 700 В.

Длину волны возбуждения / = 365 ммк получают с помощью фильтров УФС-6 (толщина 5 мм) и СЭС-24 (толщина

4 мм). В качестве источника света используют лампу ДРШ-250.-2. Концентрации полиаминов рассчитывают по калибровочным графикам и выражают в, нмоль/мг белка. Белок опре,деляют по Лоури.

П р и м e p 1. В качестве модели ткани с повышенным мнтотическнм индексом используют перевивные гепатоиы

Г-27 и 46, регенернрующую и мадигниэирующую печень. Штамм гепатомы 46 пассируют на самцах мышей линии

С3НА. Штамм гепатомы Г-27 пассируют, на крысах-самцах рандомбредного разведения. Частичную гепатэктомию проСоставитель И. Емельяненко

Редактор Л. Филь Техред Т.фанта

Корректор В,Бутяга

Заказ 3073/40 Тираж 823

ВНЙИПИ ГосуДарственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1О изводят по методу Хиггинса и Андерсона. Малигнизацию печени крыс вызывают нитрозодиэтиламином (НДЭА).

НДЭА вводят внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение 2 мес. из расчета

100 мг на 1 кг веса животного. Всего каждому животному введено 154 мг канцерогена.

Животных забивают путем декапитации. Печень немедленно извлекают.

Далее определение полиаминов проводят согласно предлагаемому способу с использованием бензол-триэтиламина в соотношении 4,5:1 °

При этом выявлено: Х„- О; путресцин - 0,32; Х вЂ” 0; спермидин — 0,37 и спермин - 0,42, где Х и Х> -фракции неиндентифицированных амйнов.

Пример 2. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензол — триэтиламин

5:1.

При этом выявлено: Х вЂ” 0,22; путресцин - 0,30; Х вЂ” 0,37; спермидин — 0,43; спермйн — 0,54.

91069 4

Пример 3. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бензал-триэтиламин

5,5:1, При этом выявлено: Х„ - 0,23; путресцин — О, 31; Х - О, 37; спермидин0,44; спермин - 0,53.

Пример 4. Определение полиаминов ведут, как в примере 1, но при соотношении бенэол-триэтиламин

6:1.

При этом выявлено: Х вЂ” О, путресцин — 0,32; Х вЂ” О; спермидин — 0,39; спермин — О, 45.

Таким образом, оптимальным для хроматографичеекого разделения указан ных полиаминов следует считать 5:15,5: 1 интервалы соотношений компоненур тов используемого растворителя, при .этом из фракций дансилпроизводных полиаминов удаляются загрязняющие их вещества Х и Х, а время анализа сокращается в 4 раза по сравнению с известным способом.