Штамм е. @ @ 1651,содержащий плазмиду @ @ 307-продуцент термолабильного токсина

 

ГОтамм E.coli KS1651, содержащий плазмиду pLT307, № 10 коллекция Наз но-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.И.Ф.Гамалеи - продуцент термолабильного токсина.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (Il) SU

А ц114 С 12 И 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -"

К ABTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) . 36) 2013/28-13 (22) 29.06.83 (46) 23.06.87. Бюл. № 23 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи (72) А.Л.Гинцбург, Н.В.Янишевский . О.А.Стафеева и Г.Б.Смирнов (53) 576.8 088.8) (56) Clements I.D. Finkelstein R.À.

"Intection and Immunity, 1979, ч.24, № 3, р.760.

Intection and Immunity, 1982, ч,36, № 1, р.215-220. (54) ШТАММ Е.СОЫ K S 1651, СОДЕРЖАЩИЙ ПЛАЗМИДУ PL Т 307-ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ТОКСИНА (57) Штамм Е.coli KS1651, содержащий плаэмиду р1Т307, ¹ 10 коллекция Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи — продуцент термолабильного токсина.

1 l 1022

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно к получению непатогенного штамма Е.coli, характеризующегося повышенной продукцией термолабильного токсина. 5

Препарат термолабильного токсина . Е.coli .является веществом, необходимым для получения вакцин и сывороток против диарейных,забблеваний человека и животных, вызываемых патогенным 10

E.coli.

Известные штаммы Е.coli, продуцирующие термолабильный токсин, являлись природными патогенными штаммами, выделенными от больных. животных и людей. Эти штаммы характеризуются относительно низкой продукцией токсина (0,4-0,5 мг íà l л культуральной жидкости).

Цель изобретения — создание генно- 20 инженерным способом высокопродуктивного штамма термолабильного энтеротоксина, непатогенного для животных и человека.

Предлагаемый штамм Е.coli KS 1651 синтезирует в 10 раз больше термолабильного токсина, чем исходный природный штамм Н74-114, выделенный от больного человека. Штамм KS 1651 является непатогенньм, так как создан на основе штамма Е.cali K12, который не может колонизировать тонкий кишечник животных и человека— ,место действия термолабильного энтеротоксина. Штамм KS 1651 содержит 35 гибридную плазмиду pLT307,созданную на основе векторной плазмиды рВВ322 и природной плазмиды„выделенной из штамма Н74-11.4 и детерминирующей синтез. термолабильного токсина. Кон- 40 струирование плазмиды pLT307 осуществляли с помощью рестриктацион.ной эндонуклеазы P st 1. Полученная гибридная плазмида содержит . вставку размером в 6 тыс.нуклеотидных пар. Количество копий плазмиды р Т308 на одну клетку штамма КБ1651 составляет около 20.

Штамм Е.coli KS!651 хранится в коллекции Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиоло.гии им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР под регистрационным номером 10.

Характеристика штамма.

Морфологические признаки. Клетки прямые палочковидной формы, i 1- 1,5х х 2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальньми жгутиками, грамотрицатель70 2 ные, неспорообразующие, не кислотоустойчивые, оксидазоотрицательные.

Культуральные признаки. Хемоорганотрофы. Метаболизм дыхательный и бродильный, каталазо-положительные.

Среда Эндо. Колонии бледно-розового цвета, блестящие с ровными краями, через 24 ч достигают 1,01,2 мм в диаметре.

Мясо-пептонный агар. Колонии беловатого оттенка, вязкой консистенции, гладкие, круглые, прижатые с ровными краями.

Кровяной агар. Колонии бледно-серого цвета, круглые с ровными краями. Гемолиз не выявлен.

Среда Эванса. Аэробные условия выращивания. Через 5 ч образуют муть.

Через 15 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь сероватого цвета.

Мясо-пептонный бульон. Аэробные условия выращивания. Через 6 ч образуют ровную интенсивную муть. Через 24 ч на дне пробирки появляется микробная взвесь серовато-белого цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Бактерии штамма Е.coli KS1651 растут в пределах от 5 до 43..С при оптимуме 37 С и рН 6,8. В качестве источника углерода используют многие угле-. воды, спирты, органические кислоты.

Глюкоза, мальтоза, арабиноза, рамноза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата.

Бактерии в качестве источника азота используют как минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Желатину не разжижают. Уреазной активностью не обладают. Индола не.образуют. Устой" чивы к тетрациклину (20 мкг/мл).

Непатогенные для лабораторных жи-. вотных

Для количественного определения термолабильного энтеротоксина использовали метод двойной диффузии в агарозном геле. Для этой цели быпи использованы препараты антитоксической противохолерной сыворотки.

Как известно, аминокислотные последовательности соответствующих субъединиц термолабильного токсина

E.coli u Vibrio cholera во многом гомологичны, а сами субъеднницы имСоставитель А.Иванова Редактор П.Горькова Техред М.Ходанич Корректор Т.Колб

Заказ 2689/3 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул. Проектная, 4

3 11 мунологически родственны. Поэтому для термолабильного токсина Е.coli применяются антихолерная сыворотка.

Использование штамма KS1651 для получения термолабильного токсина иллюстрируется следующим примером.

Пример. Бактериальные клетки объемом 50 мл выращивают в течение ночи в 0,5 л колбах в среде Эванса, содержащей 2Х-ные казаминовые кислоты, 0,6Х-ный дрожжевой экстракт, 0,25Х-.íûé NaCl, 0,87Х-ный К НР04 и 0,25Х-ный раствор глюкозы. Клет- . ки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М трис HCI рН 8,6. Клеточную суспензню подвергают озвучиванию в ультразвуковом дезинтеграторе.

При двухкратном титровании клеточных лизатов штамма KS1651 положительная реакция в гель диффузии с антитоксической противохолерной сы" вороткой наблюдается в разведении

1:128. В то же время, лизаты клеток

02270 4 штамма Н74-114, полученные в тех же условиях, в гель-диффузии проявляют активность в разведении 1:16 . Учитывая тот факт, что чувствительность этой реакции для энтеротоксина составляет 2 мкг/мл, можно считать, что концентрация термолабильного энтеротоксина в клеточных лизатах штаммов

KS l65l и Н74-114 составляет не ме10 нее 10 и 1 мг/л культуры соответственно.

Непатогенность и высокая продуктивность полученного штамма делают

15 его Ъерспективным для налаживания производства энтеротоксина Е.coli в промышленном масштабе.Энтероток" син может быть использован для получения химических вакцин, антисыворо20 ток и других диагностических препаратов против диарейных заболеваний животных и человека, вызываемых патогенными штаммами Е.coli u Vibrio

cholera.