Штамм @ @ вуд @ -2 n @ 203-продуцент амилолитических ферментов,используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта и способ получения амилолитических ферментов для осахаривания

 

1. Штамм Aspergilltis awamori ВУД Т-2 (коллекция Музея промьшшенных кольтур микроорганизмов ВНИИ Генетика, коллекционный № F 203) продуцент амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта. 2. Способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента Aspergillus awamori, ириготрвление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной об-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно в (Л процессе ферментации, о т л ич а ющ и и с я тем, что, с целью сокращес: ния сроков культивирования продуцента , повышения активности ферментов и получения наряду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы, необходимых для осакаривания при производстве спирта, в качестве проду цента используют штамм Aspergillus о awamori ВУД Т-2 № F 203, а в питасо тельную среду двумя дозами в соотно«lib шении .3:1- вводят в качестве стабилиС затора рН углекислый калыщй или ломитовую муку в количестве от 1 до Ф 10%, причем большую дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую - на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диа 5монийфосфатом . 3. СпЬсоб по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что количество по- ; сёвного материала, вводимого на ферментацию , устанавливают равным 3-10%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ГОСУДАРСТЭЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ (21) 3484285/28-13 (22) 16.08.82 (46) 23.01.85 Бюл. ))р 3 (72) Б.А.Устинников, П.Я.Бачурин, В. В. Ильинич, Н.А. Крамарский, Е.А. Двадцатова, П.А. Белозеров, Н. С. Терновский, Н. Н.Воронцова, P .Ñ. Èañàëîâà, Э.И. Бурцева, Т. Н.Писаренко, В.М.Гусева и Е.Н.Юдина (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (53) 663. 15(088.8) (56) 1. Калунянц К.А. и Голгер Л.И.

Микробные ферментные препараты. М., "Пищевая промышленность", 1979, 2. Авторское свидетельство СССР

Ф 753897, кл.-С 12 N 15/00, 1978.

3. Патент США Р 3988204, кл. 195-15, опублик. 1976.

4. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 3345897, кл. С 12 bI 9/34, 1981.

5. Авторское свидетельство СССР пр, 800185, кл. С 12 D 13/10, 1979. (54) ШТАММ АБРЕКСПДЛБ AWAMORI ВУД

Т-.2 Р Р 203 -. ПРОДУЦЕНТ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО .СЫРЬЯ

ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ (57) 1. Штамм Aspergill(1s awamori

ВУД Т-2 (коллекция Музея промьппленных кольтур микроорганизмов ВНИИ

"Генетика", коллекционный Р У 203).— продуцент амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта.

4(51) С 12 N 15/00, 9/34 С 12 R 1/665

2. Способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцента

Aspergi11us awamori, приготовление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной с(-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно в процессе фермеитеции, о т л и ч е ю- рри шийся тем, что, с целью сокращения сроков культивирования продуцен" та, повышения активности ферментов и получения наряду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы, необходимых для осахаривания при про-, изводстве спирта, в качестве продуцента используют штамм Aspergillus

awamori ВУД T-2 Ф F 203, а в питательную среду двумя дозами в соотношении .3: 1. вводят в качестве стабилизатора рН углекислый кальций или дор ломитовую муку в количестве от 1 до

10Х, причем большую дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую — на стадии ферментации по истечении 20-.24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что количество по-: севного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-10Х.

1094346

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности и касается нового штамма-продуцента амилолитических ферментов и способа получения амилолитических ферментов для осахаривания.

Известны штаммы грибов из рода

Aspergillus — продуценты амилолитических ферментов Я .

Из известных штаммов наиболее 10 близким по технической сущности и достигаемому эффекту является термостабильный штамм Aspergillus awamor T-1 N - 464 — продуцент амилолитических ферментов (2), l5

Существенным недостатком известного штамма является невысокая активность глюкоамилазы — 45-50 ед/мл и отсутствие других ферментов, необходимых для осахаривания. 20

Известен способ получения амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного 25 материала, приготовление питательной среды, культивирование продуцентов на питательной среде,. содержащей гидролизат кукурузной муки )3) .

Недостатком этого способа являет- З0 ся длительность процесса получения ферментов.

Известен также способ культивирования Aspergillus awamori — 466 на питательной среде, содержащей гидро- З5 лизованную солодом или альфа-амилазой кукурузную муку и в качестве стабилизатора рН доломитовую муку в количестве 1,5-3,0Х. Активность амилолитических ферментов через 120-130 ч 40 ферментации соответственно глюкоамилазы — 160 ед/мл, а с = амилазы—

45 ед/мл. Способ обеспечивает выход спирта 65,5 дал/т усл. крахмала 14) .

Недостатком способа является не- 45 способность штамма-продуцента синтезировать комплекс ферментов, содержащий помимо амилолитических ферментов целлюлазы и протеазы, необходимые для эффективного осахаривания крах50 малсодержащего сырья при производстве спирта, а также неустойчивость продуцента к повышенным температурам.

Из известных способов наиболее близким к изобретению по технической 55 сущности и достигаемому эффекту является способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание продуцента Aspergillus awamori на питательной среде, содержащей крахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислое железо н солодовые ростки, приготовление производственной питательной среды путем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной -амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры продуцента, ферментацию и введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевного материала с последующей стерилизацией и повторно — в процессе ферментации (5) .

Известный способ, хотя и обеспечивает получение препарата с высокой глюкоамнлазной активностью, однако содержит лишь следы o(, — — амилазы (до

4 ед/мо), что требует при осахаривании введения дополнительных источников с -амилазы.

Целью изобретения в части штамма является получение термостабильного штамма — продуцента амилолитических ферментов, продуцирующего комплекс ферментов, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта.

Цель достигается тем, что в качестве продуцента амилолитических ферментов используется термостабильный штамм Aspergillus awamori ВУД

Т-2. Штамм зарегистрирован в коллекции Музея промышленных культур микроорганизмов ВНИИ"Генетика", коллекционный номер Г 203.

Штамм Aspergillus awamori ВУД Т-2

Р Г 203 получен в результате двухступенчатой селекции исходного штамма

Т-1. На первом этапе конидии обрабатывали химическим мутагеном-этиленимином в концентрации 1:1000 в течение 1 ч с последующим рассевом на среду Чапека с высокой концентрацией крахмала (6-87). На втором этапе применен метод поддерживающей селекции с целью выбора и сохранения наиболее активного продуцента Aspergillus

awamori ВУД Т-2 N-F 203.

Диаметр колонии на 5 сут 20-24 мм, зона гидролиза крахмала 10-15 мм.

Конидии круглые с шипами.

109434Ü

Таблица 1

Штамм-продуцент

Активность, ед/мп

АС ПС

Сх

ГлА

Пр ототип

Asp. awamori

Предлагаемый .

Asp. awamori

9 F 203

50-52

О, 1-0,2

1,5-3,0

Т-1

0,5-1,0 2-4

20-25

125-130

ВУД Т-2

На среде с мальтозой характеристика колонии аналогична предыдущей.

Диаметр колонии 25-27 мм, конидиеобразование менее плотное.

На сахарозе — колония круглая, слабо скаладчатая, с обильным образованием конидий по всей поверхности.

Центр колонии плоскйй, темно-коричневый с оливковым оттенком. В среду выделяется коричнево-красный пигмент.10

Размер колоний 18-20 мм. . На лактозе — колония круглая, плоская с очень слабым конидиеобразованием по всей поверхности колонии.

Споры светло-коричневые. В среду вы- 15 деляется слабо розовый пигмент. Размер колонии 10-15 мм.

Отношение к источникам углерода: культура гидролизует крахмал, дикстрины, мальтозу, паннозу, иэо- 20 мальтозу, сахарозу с образованием глюкозы. Потребляет без выделения газа глюкозу, маннит, сорбит. Слабо растет на лактозе и ксилозе.

Отношение к источникам азота: культура хорошо ассимилирует аммонийные соли органических кислот, нитраты. Потребляет мочевину, аспа рагин, пептон, казеин, аминокислоты.

Температурный оптимум роста штам- 50

° ма 35-40 С. Развивается при концент о

Из табл 1 видно, что глюкоамилаз- ная активность предлагаемого штамма превышает активность прототипа на полусинтетической среде в 1,5-2 ра- за (60-1007). Кроме того, предлагае- 55 мый продуцент синтезирует другие ! .ферменты: сс -амилазу, протеазу, целлюлазу и липоксигеназу. рации водородных ионов от 2,8-8,0.

Аэроб. Не обладает токсическими свойствами.

Для проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ВУД Т-2

Ф F 203 проводят опыты по глубинному культивированию его в качалочных колбах вместимостью 750 мп со 100 мл питательной среды на качалке, делающей 200-230, об/мин.

Для биосинтеза глюкоамилазы использовали питательную среду следующего состава, мас.Ж:

Крахмал картофельный 6,0

NaN0q 0,91

КН 2РО4

КС1 0,05

И@80, 0,05

FeS0 0,001

Солодовые ростки 3,0

Вода Остальное.

Выращивание осуществляют в течение 72 ч при 35-40 С. Глюкоамилазную о активность определяли по ГОСТ 20264.

4-74. Штамм синтезировал наряду с глюкоамилазой протеазу, амилазу, целлюлазу и липоксигеназу.

Сравнение активностей предлагаемого штамма и прототипа приведены в табл. 1.

Целью изобретения в части способа является сокращение сроков культивирования продуцента, повышение активности ферментов и получение наряду с амилолитическими ферментами целлюжзы и протеазы, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта.

1094346

Цель достигается тем, что при способе получения амилолитических фермент о в для осахарива ния крахмалс од ержащего сырья при производстве спирта, предусматривающем выращивание посев- 5 ного материала продуцента Asp.: awamori приготовление производственной питательной среды путем гидролиза: кукурузной муки солодом или бактериальной g-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры — продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно — в процессе ферментации, в качестве продуцента используют штамм Aspergillus awamori

ВУД Т-2 ¹ 203,, а в питательн,ую сре- М ду двумя дозами в соотношении 3: 1 вводят в качестве стабилизатора рН углекислый кальций или доломитовую муку в количестве от 1 до 107., причем большую. дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую — на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом. 30

Согласно изобретению количество посевного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным

3-10%.

Предлагаемый способ получения ами- З5 лолитических ферментных препаратов для осахаривания крахмалсодержащего . сырья заключается в следующем. Посевной материал в колбах готовят на жид40 кой питательной среде, содержащеи картофельный крахмал, азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий, серно" кислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и солодовые ростки.

Выращивание осуществляют в течение

20-24 ч при 28-30 С. Подготовленную

0 жидкую посевную культуру передают на стадию культивирования в инокулятор. Для культивирования посевной культуры в инокуляторе используется

50 среда следующего состава, мас.Ж:

Мука 5-8

Кукурузный экстракт 1

Стабилизатор рН 0,75-7,5

Для ферментации в производствен- 55 ных условиях жидкую питательную сре- . ду готовят следующим образом. Куку-, рузную муку смешивают с водой в, со- отношении 1:3, разваривают при 148154 С в течение 30-50 мин охлаждают

О о 1 до 60, С и осахаривают солодовым молоком или бактериальной М -амилазой в течение 30-40 мин при 58-60 С. Затем

О вводят диаммонийфосфат в количестве

0,2 мас.7, стерилизуют при 120-125 С в течение 30-40 мин и охлаждают до о

- 35-40 С. После охлаждения в подготовленную ю питательную среду Вводят посевной материал из инокулятора.

Продолжительность кулитивирования посевного материала в инокуляторе составляет 20-24 ч при 28-30 С, непрео рывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом. На стадию фермента.— ции передают посевной материал в количестве 3-10% к объему среды.

Ферментацию осуществляют при 35о

40 С, непрерывном пер емешивании и аэрации стерильным воздухом (3040 м /м среды в 1 ч) . Через 20-24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят оставшуюся часть диам,монийфосфата (0,1 мас.% к объему среды) совместно с оставшейся частью стабилизатора рН (0,25-2,57) . Продолжительность ферментации 120-130 ч.

Готовая культура имеет следующую активность: глюкоамнла за 1 25 l

130 ед/мл, -амилаза 20-25 ед/мл, протеаза 0,5-1,0 ед/мл, целлюлаза 2-

4 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала.

Пример 1. Посевной материал

Aspergillus awamori ВУД T-2 № Р 203 в колбах выращивают на питательной" ! среде следующего состава, мас.%:

Крахмал картофельный 6,0

NaNO> 0,91

КН Ро 0,1

КС1 0,05

М8$04 0,05

Ре$04 0,01

Солодовые ростки .3,0

Вода Остальное рН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществляют в течение

20 ч при 30 С.

Для культивирования в инокуляторе питательная среда содержит следующие компоненты мас.%:

Кукурузная мука 6,0 .Кукурузный экстракт 1

Углекислый кальций 0,75

Производственную среду готовят следующим образом. Кукурузную муку смешивают с водой при 45 С в соотно

7 1094346 8 шении 1:3, полученную массу разваривают при 148 С в течение 30 мин. о

Разваренную массу охлаждают до 60 С;

О осахаривают солодовым молоком в течение 30 мин, вводят 0,2 мас. ди- 5 аммонийфосфата, стерилизуют при

120 С в течение 30 мин, охлаждают до о

35 С и вводят посевной материал из инокулятора в количестве 10 . Фермена тацию проводят при 35 С, давлении 10

0,03 MIIa и аэрации стерильным воздухом в количестве 30-40 м3/м среды в 1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин.

Через 24 ч после начала фермента- 15 ции в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.7 и углекислый кальций СаСО в количестве

0,28 мас. . Продолжительность ферментации составляет 130 ч. Активность 20 ферментов составляет: глюкоамилаза

120 ед/мл, M -амилаза 20 ед/мл, протеаза 1 ед/мп, целлюлаза 2 ед/мл.

Пример 2. Посевной материал готовят аналогично примеру 1 и производственную питательную среду, готовят аналогично примеру 1. Только на стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН. — доломитоЗО . вую муку в количестве 7, 5 мас. - u диаммонийфосфат — 0,37. Гидролиз .l (осахаривание) кукурузной муки проводят бактериальной g-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают i8 мас. и проводят ферментацию. Ферментацию осуществляют на производственной среде следующего состава, мас.7:

Кукурузная мука 25

Вода Остальное.

По истечении 24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят 0,27 диаммонийфосфата и 2,57 доломитовой муки. Ферментацию ведут в течение

120 ч. Культура имеет следующую активность .(ед/мл):06 -амилаза 30, глюкоамилаза 130, протеза 0,5, целлюлаза 1,2.

Пример 3. Посевной материал

Aspergil1us awamori ВУД T-2 У F 203 в колбах выращивают на питательной среде следующего состава, мас. :

Крахмал картофельный 6,0

NaNG 0,91

КН Р04

0 1 55

KCI 0,05

М880 0,05

FeS0 . 0,01

СоЛодовые ростки 3,0

Вода Остальное. рН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществляют в течение 20 ч при 30 с.

Для культивирования в инокуляторе питательная среда содержит следующие компоненты, мас.7:

Кукурузная мука 6,0

Кукурузный экстракт 1,0

Углекислый кальций 3, 75

Производственную среду готовят аналогично примеру 1 и вводят посевной материал из инокулятора в количестве б . Ферментацию проводят при.

35 С, давлении 0,03 ИПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 3040 м /м среды в. 1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с

150 об/мин.

Через 24 ч после начала фермента-, ции в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас., углекислый кальций СаСО в количестве

1;25 мас.X. Продолхжтельность ферментации составляет 130 ч. Активность ферментов составляет: глюкоамилаза

126 ед/мл, сС -амилаза 22 ед/мп, протеаза 0,8 ед/мп, целлюлаза 3 ед/мл.

Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала.

Пример 4. Посевной материал и производственную питательную среду готовят аналогично примеру 1, только вводят в количестве 37. На стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН вЂ” доломитовую муку 5,257 и диаммонийфосфат

0,57. Гидролиз (.осахаривание) кукурузной муки проводят бактериальной

ob-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают 18 мас. и проводят ферментацию.Ферментацию осуществляют на производственной среде следующего состава, мас. : кукурузная мука 25, вода — остальное. По истечение 24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят 0,27 диаммонийфосфата и 1,75Х доломитовой муки. Ферментацию ведут в течение 120 ч. Культура имеет следующую активность, (ед/мл):

g-амилаза 28, глюкоамилаза 128, протеаза 0,5, целлюлаэа 1,6. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала.

Пример 5. Способ осуществлякф<;аналогично примеру 1, но стабилизатор вводят в соответствии со спосо9,1094346 10 и целлюлазы не обнаруживает—

СЯ»

Преимущества способа по сравнению с прототипом представлены в табл.2.

Та блица 2

Основные показатели

Прототип штамм Т-1

Пр едлага емый штамм Т-2.

50-52

2-4

0,5-1,0

То же

45:1

6:1

144

Время выращивания, ч ти амилолитических ферментов и получение наряду с амнлолитическими ферментами целлюлазы и протеазы.

Редактор О.Юркова Техред О. Ващишииа Корректор О. Билак

Заказ 122/3 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 г

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðoä, ул.Проектная, 4 бом-прототипом — один раз в производственную среду перед стерилизацией в количестве ЗЖ. Активность глюкоами. лазы 100 ед/мп. Активность протеазы

Глюкоамилазная активность, ед/мл

Амилолитическая активность, ед/мл

Активность целлюлазы, ед/мп

Активность протеазы, ед/мл

Соотношение ферментов по амилазам

Таким образом, изобретение обеспечивает сокращение сроков культивирования продуцента, повышение активнос1,5-3

Следы

125-130

20-25