Способ определения патулина в пищевых продуктах

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА В ПИЩЕВЫХ niPOflYKTAX, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат - 85%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим , его количественным определением, отличающийся тем, что, с целью повьшения чувствительности. и достоверности анализа, перед экстракцией этилацетатом в образец BBQдят 0,1-0,2% аскорбиновой кислоты, подвергают его диализу против 8-12% водного раствора хлористого натрия, а перед очисткой экстракта последний сорбируют на силикагеле и очистку ведут путем последовательного злюирования толуолом и смесью гексанэтилацетата в соотношении 2:3-2:3,5, при этом из тонкослойной хроматографии g используют двумерную в системах хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная (Л кислота и толуол-этилацетат-85%-ная с муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82:14-16: :4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хромато§ графическую пластинку после проявления фиксир.уют парафином.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

° Цб М

РЕСПУБЛИК

3 g С 01 М 33/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЪЙ б (21) 3514717/28-13 (22) 23. 11.82 (46) 15.07.84. Бюл. В 26 (72) К.И,Эллер, Л.В.Максименко, В.С.Соболев и В.А.Тутельян (71) Институт питания АМН СССР (53) 664(088.8) (56) 1. АОАС, Official methods of

analisys, 1980, 13th. Ed.Chapter, 26,р. 430-431.

2. R.À.Meyer. Die Nahrung, 1982, 26, В 4, р.. 337-342. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАТУЛИНА

В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии ча силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе то.луол-этилацетат — 85%-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина,SU„„110314 A в ультрафиолетовом свете с последующим. его количественным определением, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности. и достоверности анализа, перед экстракцией этилацетатом в образец BBO дят.0,1-0,2% аскорбиновой кислоты, подвергают его диалнзу против 8-12Х водного раствора хлористого натрия, а перед очисткой экстракта последний сорбируют на силикагеле и очистку ведут путем последовательного элюирования толуолом и смесью гексанэтилацетата в соотношении 2:3-2:3,5, при этом из тонкослайной хроматографии используют двумерную в системах хло- Я роформ-ацетон"85Х-ная муравьиная кислота и толуол-этилацетат-85Х-ная муравьиная кислота в оббьемных соотношениях соответственно 78-82: 14-16:

:4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хромато- Ф графическую пластинку после проявления фиксируют парафином.

1103146

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при анализе пищевых продуктов на содержание микотоксина патулина.

Известен способ определения патули- на в яблочном соке, предусматривающий экстракцию патулина из образца этилацетатом, очистку экстракта на колонке с силикагелем смесью бензолэтил-ацетат (3:1), отделение патули- >р на от примесей с помощью одномерной тонкослойной хроматографии на силикагеле и обнаружение патулина по флуоресценции в длинноволновом ультрафиолетовом счете после опрыскивания I5 пластинки 3-метил-2-бензотиазолиноном (1) .

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающий экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол — этилацетат-85Х-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим его количественным определением (2).

Недостатками известных способов являются образование трудноразделяемых эмульсий при зкстракции образцов этилацетатов, вследствие чего возникает необходимость введения допол35 нительной стадии центрифугирования, резкое нарастание количества мешающих определению патулина примесей в исследуемых образцах сока после их разгерметизации, недостаточная очистка экстракта на колонке от малополярных липидных компонентов, значительно повышающих массу пробы, наносимой на хроматографическую пластинку, недостаточное разделение патулина и других экстрагируемых веществ (мешающие примеси) в условиях одномерной тонкослойной хроматографии, часто приводящее к невозможности обнаружения и идентификации патулина, от50 носительно высокая вероятность получения ложноположительных результатов вследствие наличия в экстрактах веществ, близких по хроматографическим и флуоресцентным свойствам к патули55 ну, неразделяемых в условиях одномерной тонкослойной хроматографии.

Цель изобретения — повышение чувствительности и достоверности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения патулина в пищевых продуктах, предусматривающему экстракцию образца этилацетатом, очистку экстракта методом колоночной хроматографии на силикагеле, тонкослойную хроматографию в системе толуол-этилацетат-85X-ная муравьиная кислота, проявление хроматографической пластинки хлором и раствором бензидина и обнаружение патулина в ультрафиолетовом свете с последующим его количественным определением, перед экстракцией этилацетатом в образец вводят 0,10„2X аскорбиновой кислоты, подвергают его диализу против 8-12Х водного раствора хлористого натрия, а перед очисткой экстракта последний сорби- руют на снликагеле и очистку ведут путем последовательного элюирования толуолом и смесью гексанэтилацетита в соотношении 2:3-2:3,5, при этом из тонкослойной хроматографии используют двумерную в системах хлороформ-ацетон-85Х-ная муравьиная кислота и толуол-этилацетат-85Х-ная муравьиная кислота в объемных соотношениях соответственно 78-82:14-16:4-6 и 48-52:38-42:8-12, а хроматографическую пластинку после проявления фиксируют парафином.

На чертеже представлена пластинка, на которой проводят обнаружение и индентификацию патулина.

Способ осуществляется следующим образом.

К исследуемому образцу добавляют аскорбиновую кислоту в количестве

0,1-0,2Х и выливают в целлофановый мешочек для диализа. Закреппяют мешочек в плоскодонной конической колбе, в которую предварительно помещают 8-12 водного раствора хлористого натрия и встряхивают содержимое колбы в течение трех часов. Затем диализный мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия (диализат) переносят в делительную волонку и экстрагируют этилацетатом.

Этилацетатный экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют в колбу, куда добавляют силикагель, и упаривают досуха (до консистенции пересыпающегося сухого порошка силикагеля) на ротационном испарителе при температуре водяной бани не боо лее 40 С. Затем экстракт очищают

3 1103 с помощью колоночной хроматографии.

На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию силикагеля в толуоле. Толуолу дают стечь, затем добавляют порцию толуола и засыпают в колонку силикагель с адсорбированным экстрактом. Колонку с нанесенным экстрактом промывают толуолом, патулин элюируют смесью гексан-этилацетата в соотношении 10

2: 3-2: 3, 5. Элюат упаривают на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 С.

Обнаружение и индентификацию патулина проводят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках "Силуфол". Для качественного определения пластинку размечают как показано на фиг. 1а. В точку на ðàñстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят определенную эликвоту упаренного экстракта. В точки В и С на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят стандартный раствор патулина. Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота в объемных отношениях 78-82: 14-16:4-6. Развитие хрома30 тограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандагной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 мин на воздухе. Высушенную

35 пластинку поворачивают на 90 по часовой стрелке и помещают в камеру для тонкослойной хроматографии ТСХ со второй системой растворителей толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная

40 кислота в объемных соотношениях соответственно 48-52: 38-42: 8-12. Проводят развитие пластинки во в ром направлении. Затем высушенную от растворителя пластинку помещают в камеру с

45 хлором. Атмосферу хлора в камере создают, смешивая растворы марганцевокислого калия и соляной кислоты. Проветрив от остатков хлора, пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида бензидина в муравьиной кислоте. Через

- 20 мин пластинку фиксируют в парафине, т.е. опускают на 1 с в парафин, расплавленный при 40-60 С, парафину дают стечь. Пластинку рассматривают в длйнноволновом ультрафиолетовом свете (лапма ОЛД-41 или прибор для флуоресцентного анализа витаминов, моЧ» m

С = — ----- мкг/л (мкг/кг)

V . V концентрация патулина в соке или пюре, мкг/л (мкг/кг); объем очищенного раствора экстракта в этилацетате перед ТСХ, мкл, объем раствора экстракта, наносимый на пластинку, мкл, объем сока (вес пюре), взятого для анализа, мл (г); количество патулина в пятне экстракта на пластине ТСХ, нг. м е р 1. Анализ яблочного мякоти (по предлагаемому где С

М!

П р и сока без способу). !

Для анализа берут 20 мл сока, добавляют 20 мг аскорбиновой кислоты, вылива,т в целлофановый мешочек для диализа, приготовленный из листа целлофана размером 30х30 см. Закрепляют мешочек в плоскодонной конической колбе на 250 мл, в которую предварительно добавляют 200 мл 10% †но водного раствора хлористого натрия. Колбу встряхивают в течение 4 ч на аппарате для встряхивания проб. Мешочек извлекают из колбы, водный раствор хлористого натрия переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют

100 мл этилацетата. Встряхивают, после разделения слоев верхний этилацетатный раствор отделяют. Нижний водный слой экстрагируют этилацетатом (3 50 мл). Соединенные этилацетатные

146 4 дель 833) . Патулин проявляется в виде пятен с желтой флуоресценцией. Обнаружение на пластинке пятна патулина, соответствующего по цвету флуоресценции и по хроматографической подвижности пятнам стандарта патулина, свидетельствует о наличии патулина в анализируемом продукте. Для количественного определения экстракт наносят на пластинку, размеченную,как показано на фиг. 1 б В точки С, С2, С наносят разные количества стандартного раствора патулина, в точку В также наносят стандартный раствор патулина. После проведения двумерной ТСХ, проявления пластинки и обнаружения пятен патулина, сравнивая флуоресценцию разных количеств стандарта патулина с интенсивностью флуоресценции пятна патулина в экстракте, расчитывают содержание патулина в еоке или пюре по формуле

:12) . После развития пластинки во втором направлении пластинку сушат на воздухе до полного исчезновения запаха растворителя. Для обнаружения пятен патулина пластинку помещают в камеру с хлором на 15-20 мин. Атмосферу хлора в камере создают, помешая в камеру химический стакан, в котором смешивают 50 мл 5Х-ного водного раствора марганцевокислого калия и 50 мл 25Х-ной соляной кислоты.

После извлечения пластинки из камеры с хлором ее оставляют в вытяжном шкафу до полного удаления хлора с пластинки. Затем пластинку опрыскивают 0,5Х-ным раствором гидрохлорида бензидина в 85Х-ной муравьиной кислоте. Через 20 мин пластинку опускают на 1 с в расплавленный при

57 С парафин, парафину дают стечь.

После фиксации пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете. На пластинке обнаруживается пятно с желтой флуоресценцией, находящееся на пересечении . перпендикуляров к направлениям развития хроматограммы, проведенных из пятен стандартов патулина. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта патулина с интенсивностью пятна патулина в экстракте, определяют, что пятно экстракта соответствует

2 мкл стандартного раствора с концент. рацией 5 мкг/мл т.е. 10 нг. Расчет концентрации патулина в соке:

Ч m 200 ° 10

С = — — — -= -- — — — = 10 мкг/л, Vg ° V 10 ° 20

Таким образом, в данном яблочном соке содержится 10 мкг патулина.

Пример 2. Анализ яблочного сока беэ мякоти (по известному способу) .

50 мл яблочного сока из той же партии, что и в примере 1, экстрагируют в делительной воронке 3 раза по 30 мл этилацетата. Объединенные этилацетатные экстракты сушат 1 ч

5 r безводного сернокислого натрия.

Высушенный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты и упаривают на ротационном испарителе до объема 2 мл. Затем экстракт наносят на хроматографическую колонку, приготовленную следующим образом: в стеклянную колонку диаметром 25 мм помещают слоями 8 г сипикагеля и из него 15 г безводного сернокислого натрия. Колонку элюируют 50 мл этилS 1103146 экстракты сушат сернокислым натрием (10 г) в течение 1 ч. Сухой этилацетатный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 500 мл. Сернокислый натрий промывают 25 мл свежей порции этилацетата и отфильтровывают в ту же колбу. Добавляю-. 1 г силикагеля и упаривают до консистенции сухого пересыпающегося порошка силикаге- 10 ля на ротационном испарителе при темо пературе водяной бани не выше 40 С.

Для очистки экстракта с помощью колоночной хроматографии на дно стеклянной колонки помещают кусочек ва- 1 ты, наливают суспензию 2 r (4 мл) в 20 мл толуола. Толуолу дают стечь, затем, не допуская просыхания колонки добавляют 20 мл толуола и высыпаУ ют в колонку силикагель с адсорбиро- 2О ванным экстрактом из круглодонной колбы. Дают толуолу стечь и элюируют колонку 100 мл толуола. Толуольные элюаты отбрасывают. Круглодонную колбу споласкивают 5 мл смеси гексан- 2g

-этилацетат (2:3) и выпивают раствор в колонку, добавляют 100 мл смеси гексан-этилацетат (2:3). Элюат упаривают в грушевидной колбе на 100 мл на ротационном испарителе до объема примерно 0,2 мл при температуре не выше 40 С. Полученный раствор анализируют с помощью двумерной тонкослойной хроматографии, т.е. определяют качественное и количественное содержание патулина. Для этого пластинку

"Силуфол" размером 15Х15 см размечают тонкими карандашными линиями (фиг. 1 б) . В точку А на расстоянии

1,5 см от краев пластинки с помощью микрошприца наносят 10 мкл из 200 мкл (0,2 мл) экстракта. В точку В наносят 3 мкл, а в точки С1, С, С

2 4 и 6 мкл стандартного раствора

1 патулина с концентрацией 5 мкг/мл 4> соответственно. Пластинку помещают

\ в камеру для тонкослойной хроматографии со смесью хлороформ-ацетон-85 -ная муравьиная кислота в объемном соотношении 16:3:1. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии. Пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе 5 мин. Высушенную пластинку . о 55 поворачивают на 90 по часовой стрелке и помещают в камеру для ТСХ со смесью толуол-этилацетат-857-ная муравьиная кислота (5:4:1) или (50:38:

1103146 ацетата. Элюат упаривают на ротационном испарителе до объема примерно

1 мл. Наносят с помощью микрошприца 10 мкл полученного раствора в этилацетате на пластинку "Силуфол", на ту же пластинку наносят 2, 5 и 10 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 10 мкг/мл. Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии со смесью то- 10 луол-этилацетат-85Х-ная муравьиная кислота (5:4: 1). Затем пластинку извлекают,. сушат. Пластинку обрабатывают хлором, раствором бензидина или о-дианизидина в 85Х-ной муравьиной 15 кислоте, так как это было описано в примере 1 (без фиксации пятен парафином).

Стандарты патулина проявляются в виде пятен с желтой флуоресценцией. 20

В экстракте на уровне патулина есть слабо-желтая флуоресценция, почти не различимая из-за наложения фоновой флуоресценции неотделенных мешающих веществ. Сделать надежного заключе- 25 ния о наличии патулина и оценить его количество невозможно.

Пример 3. Анализ яблочного пюре (по предлагаемому способу).

Взвешивают 10 r пюре, разбавляют дистиллированной водой до объема

20 мл, тщательно перемешивают. Далее проводят анализ так, как описано в примере 1, только соотношение компонентов в смеси хлороформ-ацетон-85Х35 ная муравьиная кислота 80:15:5, а в смеси толуол-этилацетат-85Х-ная муравьиная кислота 48:42:10. После проявления хроматографической пластинки бензидином обнаруживают, что 4б интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности флуоресценции 2 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5 мкг/мл, т.е. 10 нг. 45

Расчет концентрации патулина в пюре:

200 ° 10

С = — — — -- = 20 мкг/кг, . 10 ° 10 где V — 200 мкл, V — 10 мкл;

m — 10 нг; Ч вЂ” 10 г.

Таким образом, в исследуемом яблочном пюре обнаружено 20 мкг/кг патулина.

Пример 4. Анализ яблока г (по предлагаемому методу). 55

Для анализа берут яблоко, пораженное так называемой зеленой гнилью (на оболочке наблюдаются светло-коричневые изменения, местами на фруктовой мякоти возникают бело-серые валики плесени). Яблоко натирают на мелкой терке, полученную массу пюре смешивают, отбирают пробу для анализа (10 r), разбавляют дистиллированной водой до объема 20 мл и анализируют,как описано в примере 1. При проведении тонкослойной хроматографии эликвоту экстракта, наносимую на хроматографическую пластинку; уменьшают до 10 мкл из 500 мкл (0,5 мл). После проявления пластинки бензидином интенсивность пятна патулина в экстракте соответствует интенсивности

4 мкл стандартного раствора патулина с концентрацией 5. мкг/мл, т.е. в пятне содержится 20 нг патулина.

Расчет концентрации патулина в яблоке:

500 20

С = — — — — = 100 мкг/кг

10 ° 10

Э где У вЂ” 500 мкл, V — 10 мкл, m — 20 кг; V = 10 г.

Анализ приведенных примеров показывает, что способ-прототип (пример 2) не дает возможности определить патулин на уровне 10 мкг/кг.

В то же время использование аскорбиновой кислоты в качестве энтиоксиданта и ингибитора роста микрофлоры, диализ, колоночная и тонкослойная хроматография с описанными нововведениями, приводит к повышению чувствительности предлагаемого способа почти в 2 раза. При изучении хроматографической пластинки в -ультрафиолетовом свете пятно патулина, обладающее желтой флуоресценцией, четко различимо. Отсутствует наложение примесей на пятно патулина, в связи с чем не возникает затруднений в его качественном и количественном определении.

Примеры 3 и 4 иллюстрируют универсальность предлагаемого способа, позволяющего определять патулин в любых видах продуктов, независимо от их консистенции. Чувствительность метода также составляет 5-10 мкг/кг.

Для определения достоверности предлагаемого способа проводится анализ по предлагаемому способу и способу прототипу яблочного пюре, искусственно загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, соответствующем пределу обнаружения способа-прототипа и предельно допустимой концентрации

1103 патулина в детском и диетическом питании, установленном в ряде зарубежных стран. Исследуемые образцы пищевых продуктов до добавления в них патулина были проанализированы на содержание патулина. Результаты показывают полное отсутствие естественного загрязнения обр," .цов патулином.

Пример 5. Анализ яблочного 10 пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг по предлагаемому способу.

К .10 пробам по 10 г каждая яблочного пюре, взятым из одной банки, 1 добавляют патулин на уровне 20 мкг/кг и параллельно проводят анализ в соответствии с примером 3. На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 400 мкл очищенного экстракта. Пос- 20 ле проявления пластинок визуально определяют количество патулина в аликвоте экстракта .на пластинке, сравнивая со стандартом патулина, нанесенным на ту же пластинку. В 10 параллельных пробах на пластинках обна. руживают следующие количества: 3, 4, 4, 5, 5, 5, 5, 5, 6, 7 нг. Расчет концентрации патулина в образцах проводят по формуле 30

400 мкл ° м

С = — — — — — — — = 4 м мкг/кг, 100 мкл 10 r м = 3 нг, С = 12 мкг/кг; м = 4 нг, С = 16 мкг/кг; м = 5 кг, С = 20 мкг/кг; 35 м = 6 кг, С = 24 мкг/кг;. м = 7 кг, С = 28 мкг/кг.

Таким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненно-. го патулином на уровне 20 мкг/кг, в 4о

5 пробах обнаружено 20 мкг/кг, в 2

16 мкг/кг, в 1 — 12 мкг/кг, в 1

24 мкг/кг, в 1 — 28 мкг/кг.

Пример 6. Анализ яблочного пюре, загрязненного патулином на уров45 не 20 мкг/кг по способу-прототипу.

Для анализа берут 10 проб по 20 r каждая яблочного пюре из той же банки, что и в примере 5, добавляют патулин на уровне 20 мкг/кг и параллелью но анализируют в соответствии .с Примером 2. На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 1 мл очищенного экстракта. Большую аликвоту нанести не удается из-за большой мас- SS сы экстракта. После проявления пластинок в соответствии со способом-про тотипом визуально определяют количеТаким образом, из 10 исследованных проб яблочного пюре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, патулин достоверно обнаружен в 3 пробах, из них результат завышен в

2,5 раза в одной пробе, в 1,25 раза в другой, и только в одной пробе количество обнаруженного патулина соответствует внесенному количеству.

Результаты анализов яблочного пкре, загрязненного патулином на уровне 20 мкг/кг, проведенных по способу прототипу и предлагаемому способу

) полученные в примерах 5 и 6.

Таблица 1

Обнаруженное количество патулина, мкг/кг по способу

Порядковый номер пробы и показатели

Известный Предлагаемый

50

25

30

20 н

20 н

20 н

28

146 10 ство патулина на пластинке в экстракте, сравнивая со стандартом, нанесенным на ту же пластинку. Обнаруживают, что сделать надежного заключения о наличии патулина в экстрактах и оценить его количество невозможно в

7 пробах из-за наложения пятен с желто-коричневой флуоресценцией. В

3 пробах патулин обнаружен, визуально оценено его количество на пластин— ке: 10, 4 и 5 нг. Из расчета концентрации патулина в пюре установлено, что при м = 10 нг, С = 50 мкг/кг; м = 4 кг, С = 20 мкг/кг ° т м = 5 нг С = 25 мкг/кг, 1103146

Продолжение табл.!

Порядковый номер пробы и пока1 эатели

Среднее отклонение, мкг/кг

13, 30

2,96

Стандартное отклонение, мкг/кг

17,07

3,60

Относительное стандартное отклонение, 7

179,6

18,3

Доверительные границы для среднего значения, . мкг/кг

9,5w12,2

19,6+2,5

Коэффициент вариации

1,28

0,13

30 чественного

Обнаруженное количество ° патулина, мкг/кг по способу 5

Известный Предлагаемый

П р и м е ч а н и е. н — невозможность идентификации и колиопределения патулина 35

Статистическая обработка результатов анализов показывает, что среднее значение обнаруженного количества патулина при анализе способом-прототипом занижено на 52,57 против дей40 ствительного, при этом вариабельность результатов 1287, что свидетельствует о недостоверности способа-прототипа (р > 0,1). Предлагаемый способ дает достоверные результаты (р (0,05)

45 при вариабельности 13Х. При этом среднее значение полученных результатов отличается от действительного на 2Х.

Выбранный интервал аскорбиновой кислоты О, 1-0,2Х является оптимальным. Добавление меньшего количества аскорбиновой кислоты влечет за собой ускоренный рост загрязнения аналитической пробы продуктами, затрудняющи- S ми хроматографическое определение патулина. Превышение уровня (0,2Х количества аскорбиновой кислоты) не улучшает качество анализа пищевого продукта по сравнению с выбранным интервалом (0,1-0,27) и поэтому нецелесообразно. Кроме того, более высокие концентрации аскорбиновой кислоты (порядка 57) при добавлении к яблочному соку приводят к полному разрушению патулина, содержащегося в образце в количестве 300 мкг/кг на 17-й день хранения.

Пример 7. Анализ образца яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предлагаемому способу с добавкой аскорбиновой кислоты на уровне 0,027.

К 20 мл яблочного сока, загрязненного патулином на уровне 100 мкг/л, добавляют 4 мг аскорбиновой кислоты.

Анализ проводят аналогично примеру 1.

Получают хроматограмму, представленную на фиг. la откуда видно, что. флуоресцирующие в длинноволновом ультрафиолетовом свете примеси закрывают хроматографическое поле и не дают возможность обнаружить патулин в экстракте после соответствующего проявления. Для сравнения на фиг.1б приведена хроматограмма, полученная в результате анализа, .рассмотренного в примере 1.

Использование 8-127.-ного водного раствора хлористого натрия при диализе имеет целью создание более высокого осмотического давления во внешнем диализном пространстве, что обеспечивает нужное направление процесса диализа. Использование более низких чем 87-ных концентраций раствора хлористого натрия может приводит к разбавлению образца внутри диалиэного мешка и связанным с этим потерям патулина. При концентрации хлористого натрия выше 12Х происходит повышен-, ная диффузия воды из диализного мешочка, что приводит к заметному увеличению вязкости анализируемого образца и снижению скорости диффузии, патулина во внешнее диализное прост- ранство, снижению извлечения патулина из образца.

Пример 8. Анализ нектара

"Свежесть", загрязненного патулином на уровне 100 мкг/кг, по предложенному способу при концентрации хлористого натрия в воде во внешнем диализном простРанстве 3, 8, 10, 12 и 17Х.

»0314

Продолжение табл . 2

Показатели

Объем раствора во .внешнем диализном

Таблица 2

Пок аз атели

Объем раствора во внешнем диализ нам

Для анализа берут 5 проб по 20 мл нектора, представляющего собой смесь яблочного и морковного соков с мякотью, добавляют патулин на уровне

100 мкг/л. Анализ проводят аналогич- 5 но примеру 1. Исключение составляет стадия диалиэа, где во внешнем диализном пространстве используют водный раствор хлористого натрия 3, 8, 1О; 12, 17Х. После стадии .диализа замеряют объем диализата (табл. 2).

На хроматографическую пластинку наносят 10 мкл из 2000 мкл. Сравнивая с различными количествами стандарта патулина, в каждом иэ 5 экстак- 15 тов определяют 7 нг для ЗХ-ного раствора хлористого натрия, 9 нг для

8Х-ного, 10 нг для 10Х-ного, 9 нг для 12Х-ного, 8 йг для 17Х-ного. Ðàñчет концентрации патулина в образце 20 проводят но формуле

2000 мкл 7 нг (ЗХ) С вЂ” — — — — — — 70 мкг/л

10 мкл ° 20 мл т

2000 мкл.9 нг (8X) С вЂ” — — — — — — — — 90 мкг/л °

10 мкл.20 мл т.

2000 мкл ° 10 кг (10X} С вЂ” -- — - — — — — — 100 мкг/л

10 мкг 20 мл 30

2000 мкл 9 нг (12Х) С вЂ” -- — — — — — — — 95 мкг/л.

10 мкл 20 мл т

2000 мкл 8 нг (17Х) С вЂ” — — — — — — — 80 мкг/л . 35

10 мкл 20 мл

Влияние концентрации раствора хлористого натрия во внешнем диализном пространстве на потери патулина при анализе предлагаемым способом показа ® но в табл. 2.

Исходная концентрация раствора хлористого натрия во внешнем диализном пространстве, Х

3 8 10 12 17 пространстве до диализа, мл 200 200 200 200 200

Исходная концентрация раствора хлористого натрия во внешнем диализном пространстве, Х

3 8 10 12 17 пространстве после диалиэа, мл 185 195 200 195 190

Потери патулина при аназе, X 25 10 О 10 20

Из примера 8 видно, что потери патулина минимальны при предлагаемых.

,онцентрациях раствора хлористого натрия во внешнем диализном простран-стве.

П р и" м е р 9. Анализ образца нектата "Свежесть", загрязненного патулином на уровне 20 мкг/л, по предложенному способу за исключением соотношения растворителей для КХ, злюирущих патулин с колонки.

Для анализа берут 2 пробы по 20 мл нектара, добавляют патулин на уровне 20 мкг/л. Анализ проводят аналогично примеру 1 за исключением соотношения растворителей для элюирования патулиновой фракции с колонки: для пробы У 1 используют систему гексанэтилацетат (2:2), для пробы Ф 2— гексан-этилацетат (2:4,5), т .е. варьируют количество этилацетата в системе относительно граничных значений. На ТСХ пластинку наносят 0,53 мкл стандартного раствора патулином с интервалом в 0,5 мкл и 10-мкл из 400 мкл очищенного экстракта.

Пластинку проявляют и обнаруживают патулин в экстракте Ф 1 в количестве

5 нг на пластинке (интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте соответсвует интенсивности флуоресценции 0,5 мкл стандартного раствора с концентрацией 10 нг/мкл).

В образце В 1 обнаружено

400 мкл 5 нг

С вЂ” — — — — — — -- — 10 мкг/л

10 мкл 20 мл У

1103146

11родолжение табл.3

2 Э

2. То же

80.15.5 0,50

78:14:4 0,36

3. То же

4. Толуол-этилацетат-857.-ная муравьиная кислота

52:42:12 0,52

50:40:10 0,43

5. То же

6. То же

48:38:3 0,34

1; Хлороформ-ацетон-857-ная муравьиная кислота

82:16:6 0,64

)5 т.е. только 507 внесенного патулина.

Экстракт Ф 2 отличается большей массой после упаривания растворителя.

Нанесение 10 мкл из 400 мкл затруднено, происходит пересыщение активного слоя силикагеля в точке нанесения экстракта, качество хроматографического отделения патулина от других компонентов экстракта резко снижается

> пятна не имеют округлой формы и чет- 10 ких очертаний, размазаны по хромато-. графическому полю. Это делает невозможным индентификацию и количественное определение патулина в экстракте.

Из примера 9 видно, что при содер- 1 жанни этилацетата в системе ниже чем

3!2 гексана, патулин не полностью элюируется с хроматографической Ко лонки, причем чем больше отклонение от предлагаемого соотношения раство- 2п рителей, тем больше потери патулина.

Увеличение содержания этилацетата в системе больше чем 2:3,5 приводит к увеличению полярности системы и наряду с патулином элюируется большое 2S количество прочих компонентов экстракта, значительно увеличивающих массу экстракта, что резко затрудняет проведение двумерной ТСХ. Соблюдение при КХ границ предлагаемого соотношения гексан-этилацетат позволяет практически полностью смывать с колонки патулин, оставляя на старте большую часть примесей.

B системе растворителей при дву35 мерной ТСХ изучена хроматографичес. кая подвижность патулина и других компонентов экстракта яблочного пюре . в предложенных системах хлороформ-ацетон †8-ная муравьиная кислота и толуоя

-этилацетат-857.-ная муравьиная кислота при граничных и средних значениях концен. траций растворителей в с;" темах.

В табл. 3 представлена хроматографическая подвижность патулина в изу- 45 чаемых системах растворителей.

Таблица 3

Критерием оптимальности хроматографирования вещества в тонком слое являются нахождение пятна патулина в интервале Rf между 0,35 и 0,65, а также правильная форма и четкие границы пятна, отсутствие наложения близких к патулину по флуоресцентным свойствам компонентов экстракта.

Отмечено, что в системе 1 значение Rf патулина находится на верхней границе указанного интервала и дальнейшее увеличение концентрации полярных компонентов в системе приводит к превышению КЕ значения 0,65 и.,следовательно,к ухудшению качества ТСХ (фиг. За). Система 4 имеет тенденцию расслаиваться, хотя значение Rf патулина удовлетворяет оптимальным условиям ТСХ. Системы 3 и 6 представляют собой граничный случай, когда дальнейшее уменьшение содержания полярных компонентов .в системе приводит к снижению Rf c 0,35 и ухудшению качества ТСХ (фиг. Зб). Только промежуточные соотношения компонентов (системы 2 и 5) позволяют максимально отделить пятно патулина от пятен других компонентов экстракта, пятна соединений имеют округлую форму, четко очерчены, О, 35 (Rf 0,65, т. е. соблюдаются правила качественного проведения ТСХ, обеспечивающие возможность безошибочного обнаружения, индентификации и количественного определения патулина в экстрактах пищевых продуктов.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность и достоверность анализа

1103146

Составитель Л.Пашинина

Техред M.Tåïåð Корректор О.Тигор

Редактор В.Ковтун

Филиал ППП "Патент", r,ужгород, ул.Проектная, 4

Заказ 4971/33 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5