Способ определения концентрации фибронектина в растворе

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРОНЕКТИНА В РАСТВОРЕ путем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц , покрытых желатиной, с последующей регистрацией агглютинации, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа , в качестве агглютинируемых частиц добавляют клетки Staphylococcus epidermidis, ковалентно связанные с желатиной глутаровьм альдегидом инкз бацией в течение 1-2 ч при рН 7,58 ,0 при концентрации желатины 0,10 ,57а. 8

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (1Ю (И) 051 А зов G 01 N 33/48 с В

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3516449/28-13 (22) 03.11.82 (46) 07.08.84. Бюл. N - 29 ,(72) О.Д. Зинкевич, P.È. Литвинов, M.Ñ. Куравская, Р:Г. Иухутдинова и Д.M. Зубаиров .(71 Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и Казанский медицинский институт им. С.В. Курашова (53) 612.115(088.8) (56) 1. Cheek Т.Т., Wolsman Н.С., Со1еу I.Â., Hunter R.S., Т. Reticuloendothel soc. 1979, 25, 4, р. 351362. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРОНЕКТИНА В РАСТВОРЕ путем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц, покрытых желатиной, с последующей регистрацией агглютинации, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве агглютинируемых частиц добавляют клетки Staphylococcus

epidermidis, ковалентно связанные с желатиной глутаровым альдегидом инкубацией в течение 1-2 ч при рН 7,58,0 при концентрации желатины 0,10,5Х.

51 2

BHHHIIH Заказ 5751/31 Тираж 823 . Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул,Проектная,4

1 «070

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к химии белка и, клинической лабораторной диагностике.

Известен способ определения концентрации фибронектина путем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц, покрытых желатиной, с последующей регистрацией аглютинации (.1 1.

Этот способ характеризуется недостаточной чувствительностью (не более 0,3-0,5 мкг).

Кроме того, к недостаткам способа относятся его длительность, необходимость использования дорогостоящего оборудования и труднодоступность ком-. понентов, необходимых для приготовления агглютинируемых частиц на основе карбоксилатекса. 20

Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации фибронектина в растворе пу-2q тем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц покрытых

У желатиной, с последующей регистрацией агглютинации, в качестве агглютинируе мых частиц добавляют клетки Staphyl.ococcus epidermidis, ковалентно связанные с желатиной глутаровым альдегидом инкубацией в течение 1-2 ч при рН 7,58,0 прЦ концентрации желатины О, 1-0,5%.

Способ осуществляется следующим

35 образом.

Получают желатинизированные стафилококки, предварительно убитые нагреванием при 80 на водяной бане в течение 30 мин. Для этого взвесь убитых клеток Staphylococcus epidermidis с концентрацией 20 млрд/мл в

О, 15 И К НРО смешивают с 0,1% раствора глутарового альдегида в О, 15 И

К2НР04 H перемешивают в Те еННе 1 ч 45 при 37О Затем раствор подкисляют НС до рН 5,0 и отделяют суспензию клеток центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Отмытый осадок суспендируют в 0,15 И К НРО4 до концент50 рации 10 млрд/мл, смешивают с О, 10,5Х-ным раствором желатины и инку" бируют в течение 1-2 ч при рН 7,58,0. Желатинизированные клетки отделяют от непрореагнровавшей желатины центрифугированием и трижды промывают

0,15 М К НРО4 при 4000 об/мин в течение 15 мин, после чего суспендируют в растворе Хенкса (рН 7,2-7,4) до конечной концентрации 2 млрд клеток/мл. Желатинизированные клетки хранят в ампулах, запаянных и прогретых в течение, 1 ч при 80 С.

Для постановки агглютинационной пробы в микротитрационных пластинах создается ряд 2-кратных разведений раствора очищенного фибронектина.в растворе Хенкса с исходной концентрацией белка 200 мкг/мл. Разведение делают раствором Хенкса, содержащим

20 ед/мл гепарина. Объем пробы, вносимый в первое углубление пластины, составляет 10.мкл. После перемешивания в каждое углубление вносят по 10 мкл желатинизированных стафилококков. В две контрольные лунки вносят

10 мкл суспензии нежелатинизированных с стафилококков и 10 мкл фибронектина (200 мкг/мл в растворе Хенкса с гепарином 10 мкл суспензии желатинизированных стафилококков и 10 мкл раствора Хенкса с 20 ед/мл гепарина. Пластину инкубируют при 37 С в течение

1 ч. Регистрация результатов проводится визуально или микроскопически.

Концентрацию фибронектина в сыворотке определяют, делая ряд аналогичных разведений исследуемой сыворотки и сравнивая результаты агглютинации с результатами агглютинации стандартных разведений фибронектина.

Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает более высокую чувствительность (0,125 мкг в пробе), 10-кратное сокращение времени определения, использование меньшего объема анализируемого раствора, прямую визуальную или микроскопическую оценку результатов определения, использование легкодоступных материалов для приготовления агглютинируемых желатинизированных частиц.

Предлагаемый способ не требует использования сложного оборудования и может быть легко воспроизведен в клинических и медико-биологических лабораториях.