Рекомбинантная плазмидная днк @ 435,кодирующая синтез днк- лигазы фага т 4.способ ее конструирования и штамм @ . @ вкм в-1449-продуцент днк-лигазыфага т4

 

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pILL435, кодирующая синтез ДНКлигазы фага Т4, состоит из следующих элементов: -плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо, -Hindlll-EcoRI - фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага Т4

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3332486/30-15 (22) 06.08.81 (46) 15.12.85. Бюл. ))= .46 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) В. И. Таняшин, А. С. Солонин, Б. M. Трояновский и А. А. Баев (53) 575.113:577.)5(088.8) (56) Velten J., Abelson J. 3. Nol.

Biol 1980, 137, 235-248.

Wilson С. G., Murray N. Е. .). Мо1. Biol., 1979, 132, 471-492.

Panet А. et al., Biochemistry, 1975, 12, 5045-5050. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

pILL435, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ ДНК-ЛИГАЗЫ ФАГА Т4, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ E.coli ВКМ В-1449

ПРОДУЦЕНТ ДНК-ЛИГАЗЫ ФАГА Т4. (57) 1. Рекомбинантная плазмидная

ДНК pILL435, кодирующая синтез ДНКлигазы фага Т4, состоит из следующих элементов: — плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо, — HindIII-EcoRI — фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы фага

Т4 (0,7 тпо), — два EcoRI фрагмента ДНК фага Т4 (0,5 и 0,4 тпо), включающие часть .гена ДНК-лигазы Т4 с собственным промотором, — EcoRI-EcoRV — фрагмент ДНК фага лямбда (1,0 тпо) из района между

26780 и 27800 парами нуклеотидов генома фага лямбда, — ВапйП-BglII — фрагмент фага лямбда (1,2 тпо), содержащий Р) промотор и интактный ген N фага лямбда, (51) 4 С )2 N 15/00 (С 12 N 15/00, С 12 R 1:19) — два BglII фрагмента (2,4 и 0,6 тпо), содержащие гены регуляторов транскрипции с ранних промоторов фага лямбда с мутациями с)857(сз) и сто ат6 и промоторы P„, Р „, Р,, — фрагменты содержат следующие гены:

bla — ген, обеспечивающий синтез (— лактамазы, lig Т4 — ген ДНК-лигазы фага Т4, N — ген фага лямбда — антитерминатор транскрипции, rex — ген, запрещающий размножение

rll мутантов фага Т4, с1 — репрессор фага лямбда, cro — второй репрессор Фага лямбда и промоторы Р, P,,Р

Р„„РЕ; — молекулярная масса рекомбинантной плазмидной ДНК равна 7,1 Мд (размер — 11,1 тпо).

2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК pILL435, кодирующей синтез ДНК-лигазы фага

Т4, заключающийся в том, что смесь плазмидной ДНК pBR322 и ДНК фага

gNN 816-1 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции

HindIII и EcoRV, полученные фрагменты соединяют ДНК-лигазой, затем смесью рекомбинантных молекул трансформируют клетки Е.coli lig ts7, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших при непермиссивных условиях клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4, затем полученную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции

BamHI, продукты гидролиза с помощью

ДНК-лигазы соединяют с BamHI-BglII— фрагментами ДНК фага )) с1857 сго аш6, после трансформации клеток

Е.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда и из них выделяют, рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.

1122003

3. Штамм Escherichia coli BKN

 — 1449Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН

CCCP) — продуцент ДНК лигазы фага Т4..

Изобретение относится к микробиологической промышленности и молекулярной биологии и представляет собой рекомбинантную плазмидную

ДНК, обусловливающую синтез ДНКлигазы фага Т4, способ конструирования данной рекомбинационной плазмидной ДНК и штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду — суперпродуцент ДНК-лигазы фага Т4.

ДНК-лигаза фага Т4 — один из основных ферментов, используемых в генетической инженерии при конструировании гибридных молекул.

Известны рекомбинантные ДНК, определяющие синтез ДНК-лигазы фага Т4. Описанная в работе плазмида включает ДНК векторной плазмиды

pBR313 и фрагмент ДНК фага Т4, содержащий полный ген ДНК-лигазы с собственным промотором. Описанная рекомбинантная плазмида не обеспечивает достаточно высокий уровень лигазной активности (см. табл. 1).

В работе $2(был сконструирован рекомбинантный фаг, содержащий полный ген ДНК-лигазы фага Т4.

Эффективный синтез ДНК-лигазы фага Т4, осуществляемый с громотора Р, векторного фага, обусловливал в 300 раз более высокое содержание этого фермента в сравнении с клетками E.со11, инфицированными фагом Т4 . Однако одновременно в инфицированных клетках рекомбинантный фаг продуцирует сопутствующие ферменты, например Ъ -экзонуклеазу— фермент, который значительно затрудняет очистку основного продукта.

Известный способ конструирования рекомбинантной плазмиды, содержащей ген ДНК-лигазы фага Т4, описанный в работе 11), состоит в том, что фрагменты ДНКфага Т4,продуцируемые эндонуклеазой рестрикции HindIII, 10

f5

40 объединяют с мультикопийной векторной плазмой pBR131, предварительно гидролизованной эндонуклеазой рестрикции Hindlll. Гибридными плазмидами трансформируют клетки E.coli

lig ts7 у которых при повышенной температуре не функционирует ДНКлигаза. Трансформанты с искомыми рекомбинантными плазмидами выращивант при температуре, непермиссивной для роста кле-ок E.coli lig ts7.

Из выросших клеток выделяют плазмид— ную ДНК, структуру которой исследуют рестрикционным анализом. Было показано наличие в рекомбинантных плазмидах фрагмента размером 1,9 тпо (тысяч пар оснований), включающего полный ген ДНК-лигазы фага Т4. Однако содержание этого Фермента в клетках в этом случае низкое (см. табл. 1).

К недостаткам данного способа можно отнести также то, что для конструирования рекомбинантной плазмиды не используют фрагменты ДНК, которые содержат промоторы, обеспечивающие высокий уровень синтеза

ДНК-лигазы.

Применяемый в работе способ получения рекомбинантной ДНК предусматривает использование ДНК фага НМ816 в качестве вектора. Фрагменты ДНК

Т4, продуцируемые рестриктазой EcoRI при ограниченном гидролизе, вводят в ДНК этого фага и отбирают фаги, которые размножаются на Е.coli

lig ts7 при 37 С и образуют лизогены о о при 43 С. Были обнаружены рекомбинанты, содержащие ген ДНК-лигазы фага Т4. Эти рекомбинантные фаги получены введением в вектор трех

EcoRI — фрагментов ДНК фага Т4, включающих полный ген ДНК-лигазы.

Синтез ДНК-лигазы проходил после

45 индукции профага, которую проводят следующим образом: лизогенные клет3 11 о ки подращивают при температуре 30 С

5 до титра 3,5 10 кл/мл, инкубируют 15 мин при 43 С, затем культивируют клетки при 37 С в течение 3 ч.

Однако способ конструирования рекомбинантного фага лямбда с полным геном лигазы не обеспечивает получения штамма Е.coli с достаточно высоким содержанием ДНК-лигазы фага Т4.

Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и регуляторную область фага лямбда, в литературе не описан.

Известны следующие штаммы †прод центы ДНК-лигазы фага Т4 (см. табл. 1): а) клетки Е.coli В, инфицированные фагом Т4 am N82, которые содержат по нашим данным 168 единиц фермента на грамм биомассы; б) штамм Т.coli K802, несущий плазмиду рТГ113012 с HindIII фрагментом ДНК фага Т4, включающим ген

ДНК-лигазы фага Т4. Штамм имеет низкий уровень синтеза фермента (11; в) штамм Е.coli NN989 является производным от штамма Е.coli AA125, лизогенным по фагу g с1857 W am 403, Е am 1100 S am100 Т4 lig, который несет ген ДНК-лигазы фага Т4 12) и обеспечивает при термоиндукции уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4, равный 4800 единиц на грамм клеток.

Уровень синтеза ДНК-лигазы Т4 в перечисленных штаммах недостаточно высок. Кроме того, перечисленные штаммы (а) и (в) продуцируют сопутствующие ферменты, которые усложняют способ получения ДНК-лигазы, что увеличивает время очистки и снижает выход конечного продукта.

Целью предлагаемых объектов изобретения является увеличение содержания ДНК-лигазы фага Т4 в клетках бактерий.

На фиг. 1 изображена схема рекомбинантной плазмидной ДНК PILL 435 с рестрикционной и генетической картами (Р— — обозначение основных

L промоторов и направление транскрипции); на фиг. 2 — электрофореграмма фрагментов ДНК рекомбинантной плазмиды рП.1. 435, полученных при гидролизе эндонуклеазами рестрикции

BglII (1), EcoRI (2), HjndIII (3) и при совместном гидролизе Ваш HI u

Нра1 (4), HindIII u EcoRV (5), SalI и НраТ (6); электрофореграмма

Ватп HI — фрагментов ДНК A (7), (5) 22003 4

EcoRII — фрагментов ДНК pBR 322 (S), BamHI — Bgl ll — фрагментов ДНК рП.

203 !9); слева приведены размеры фрагментов ДНК PILL 435, справа отмечены размеры маркеров (в тыс. пар оснований): на фиг. 3 — схема конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК

pILL 435, обеспечивающей синтез

ДНК-лигазы Т4; на фиг. 4 — электро10 фореграмма частично очищенных с помощью фосфоцеллюлозы P-ll (пример 1) белков из экстрактов клеток:

Е. cali АА125/рВР 322 lig 35 (2)

Е. coli AA125 (Т4 lig С1857

Wam 403 Еаш 1100 Sam 100) (3)

Е. coli АА125/PILL 435 (4)

Электрофореграмма очищенного фермента ДНК-лигазы

Т4 и белковых маркеров с обозначенными размерами (l)

Рекомбинантная плазмидная ДНК

pILL435, кодирующая ДНК-лигазу фага Т4, состоит из следующих элемен25 тов: — плазмидная ДНК вектора pBR322, размер которой 4,36 тпо, — HindIII-EcoRI — фрагмент, содержащий часть гена ДНК-лигазы

30 фага Т4 (0,7 тпо), — два EcoRI — фрагмента ДНК фага Т4 (0,5 и 0,4 тпо), включающие часть гена ДНК-лигазы Т4 с собственным промотором, — EcoRI-EcoRV — фрагмент ДНК фага лямбда (1,0 тпо) из района между

26780 и 27800 парами нуклеотидов генома фага 3 .. — BamHI-BglII — фрагмент hara лямбда (1,2 тпо), содержащий Р промотор и интактный ген И фага лямбда, — два BglII — фрагмента (2,4 и

0,6 тпо), содержащие гены регуляторов транскрипции с ранних промоторов фага лямбда с мутациями с1857

45 (ts) и cro аш6 и промоторы Р, Р,, Рк.

Молекулярная масса гибридной плазмиды pILL435 равна 7,1 Мд (размер

11,1 тпо) (фиг. 1, 2).

50 Для достижения цели используют способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей ДНКлигазу фага Т4, заключающийся в том, что смесь плазмидной ДНК pBR322

55 и ДНК фага 9, NM816-1 подвергают совместному гидролизу эндонуклеазами рестрикции HindIII и EcoRV, образовавшиеся фрагменты соединяют

S 1

ДНК-лигазой, затем полученной смесью трансформируют клетки Е.coli

lig ts7, трансформанты высевают на среду с ампициллином и из выросших при непермиссивных условиях клонов выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4, затем полученную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции BamHI, продукты гидролиза с помощью ДНК-лигазы соединяют с BamHI u BglII-фрагментами ДНК фага c1857 cro am6, после трансформации клеток Е.coli отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда и из них выделяют рекомбинантную плазмидную ДНК plLL435 (фиг. 3).

Выбор штамма Е.coli lig ts7 обусловлен тем, что клетки Е.coli

lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды с интактным геном ДНК-лигазы Т4, способны расти при 43 С в отличие от клеток Е.coli lig st7, не содержащих рекомбинантные плазмиды с полным геном ДНК-лигазы фага

Т4.

Для достижения цели используют штамм Escherichia coli BKM В-1449Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) — продуцент

ДНК-лигазы фага Т4.

Штамм-продуцент ДНК-лигазы фага

Т4 получен трансформацией клеток

Е.coli AA125 плазмидой pILL435.

Содержание ДНК-лигазы фага 74 в сконструированном штамме равно

50000 единиц на 1 г биомассы клеток.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ

АН СССР под номером ВКМ В-1449Д.

Штамм Escherichia coli ВКМ

В-1449Д характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки прямые, палочковидной формы 1,21,6 х 2,0 х 6,0 мк, подвижные, с перитрихиальными жгутиками, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки: клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре

"Дифко — колонии гладкие, круглые, прижаты, блестящие, серые, край ровный, мутные. При росте в жидких средах — мясо-пептонном бульоне, LB áóëüoíå образует ровную интенсивную муть.

122ОО3 в

Физиолого-биохимические признаки: клетки растут в пределах от 4 до 45 С при оптимуме рН от 6,8 до

7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности:

d-глюкозу, d — фруктозу, арабинозу, лактозу, трегалозу. Не усваивают ацетат, аданит, галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазная активность не обнаруживается.

Устойчивость к антибиотикам: проявляет устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазмиды р ПЛ,435 .

Штамм Е.coli ВКМ В-1449Д проявляет иммунитет к суперинфицирующему фагу лямбда.

Пример 1. Клетки бактерий

Е.cali K802, содержащие плазменную

ДНК pBR322, выращивают в 10 мл

8 бульона до титра 1х10 кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5.000g, 5 мин, +4 С) и ресуспендируют в

0,1 мл лизирующего раствора (лизоцим — 2 мг/мл, трис-НС1, рН 8,025 мМ, ЭДТА — 10 мМ, глюкоза — 50 мМ), о выдерживают 5 мин при 0 С. Далее прибавляют 0,2 мл раствора (11аOH—

0,2 И, додецилсульфат натрия — 1Z) и перемешивают до осветления лизата.

150 мкл раствора 3 M ацетата натрия (pH 4,8) вносят в осветленный лизат, осторожно перемешивают до заметного снижения вязкости раствора, выдерживают 1 ч при +4 С и образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (1000g, 5 мин, +4 С). К полученному супернатанту добавляют 2,5 объема о охлажденного при -40 С этилового о спирта и выдерживают 2 ч при -40 С.

Образовавшийся осадок собирают, центрифугированием (5000g, 5 мин, 20 С) и ресуспендируют в 0,2 мл буфера (10 мМ трис — НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).

Препарат вирионов фага ИМ816-1 получают инфекцией экспоненциально растущей культуры E.cali С600 с множественностью 1 в среде LB (10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaC1 на л воды), з содержащей 10 M MgSO . Лизис клеток завершают добавлением в среду хлоро7 11 форма (1:100) . После удаления облом— ков клеток центрифугированием (6000, 30 мин, 4 С) клеточные ДНК и PHK лизата гидролизуют одновременно панкреатическими ДНКазой и РНКазой (по 10 мкг/мл) при 20 С, 1 ч. Первичную очистку и концентрирование фага проводят с помощью полиэтиленгликоля 6000 (Jomamoto К. Р. et al., Virology, 40, 734-744, 1970). Окончательную очистку фага проводят равновесным центрифугированием в 4 М

СзС1, 10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 0,01 М

MgCl> (Wilson G. G. et al., Molec.Gen.Genet., 156,203-214, 1977).

Очищенный препарат фага NM16 1 диализуют против буфера (10 мМ трис—

НС1, рН 8,0, 1 MM ЭДТА).

ДНК фага NM816 1 выделяют фенольным меотодом (Таняшин В. И. и др., Мол. биол., 6, 803-815, 1974). Концентрацию ДНК фага и плазмиды определяют спектрофотометрически при

260 нм с использованием коэффициента г экстинкции 0,02 см /мкг. Плазмидную

ДНК выделяют по методу Birnboim H. С., Doly J., Nucl.Acids Res., 1979, 7, N 6, 1513-1523.

Полученные препараты ДНК плазмиды

pBR322 и фага NM816-1 используют для конструирования рекомбинантной плазмиды pBR322 lig 35 (схема фиг. 3), которое проводят следующим образом:

0,5 мкг ДНК плазмиды pBR322 смешивают с 3 мкг ДНК фага МЫ816- 1 и инкубируют с эндонуклеазами рестрикции

HindIII (5 ед.) и EcoRV (5 ед.) в буфере А (50 мМ трис-НС1, рН 7,6, 50 мМ МаС1, 10 мМ МдС1,, 1 мМ 2меркаптоэтанол). Реакцию проводят о при 37 С 1 ч. После инкубации смесь о прогревают при 65-70 С )0 мин.

Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Соединение фрагментов ДНК плазмиды и фага проводят в буфере А с добавлением

АТч и дитиотреитола до конечной концентрации 0,5 мМ и 5 мМ соответственно, и ДНК-лигазы фага Т4 (3000 ед/мл ) из расчета 1 мкл фер— мента на 5 мкг ДНК 8-10 ч при 8 С, о затем смесь разводят в 10 раз буфером А с повторным добавлением ДНКлигазы фага Т4 и инкубируют смесь

10 ч. Полученную смесь рекомбинантных плазмид используют для трансформации клеток Е.со1 lig ts7. Трансформацию проводят следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток

22003!

О

Е.coli lig ts7 вносят в 10 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 3х10 кл/мл. >осле 10-ми8 с нутного охлаждения (О С) клетки собирают центрифугированием (5000g, 10 мин, О С), суспендируют в 10 мл

0,1 М раствора СаС1 и выдерживают

1 ч. Клетки повторно центрифугируют о (5000g, 10 мин, 0 С), затем ресуспендируют в 0,5 мл 0,1 M СаС! (О С) и используют для трансформации через 10-15 ч.

Смесь соединенных фрагментов ДНК инкубируют с компонентными (обработанными CaC1 ) клетками 1 ч при

0 С и 10 мин при комнатной темперао туре (18 — 22 С). После десятикратного разбавления бульоном LB трансформированные клетки подращивают 2 ч и высевают на агаризованную среду

LB с ампициллином (20 мкг/мл).

Трансформанты отбирают при непермиссивной для исходных клеток Е.coli о

1ig ts7 температуре (43 С) . Из клеток, выросших за 24 ч клонов, выделяют плазмидную ДНК по методике, описанной выше.

Плазмидную ДНК, содержащую полный ген ДНК-лигазы фага Т4 и обозначенную pBR322 lig35 используют в качестве реципиента при конструировании плазмиды pILL435 (схема фиг. 3).

В качестве донора регуляторной области фага лямбда используют ДНК фага ф c1857 cro аш6. Препарат вирионов этого фага получают термоиндукцией лизогенной культуры Е.cali C600 (A c1857 cro am6), которую проводят следующим образом: лизогенную кульо туру подращивают при 30 С до титра

Зх!0 кл/мл, затем инкубируют при о

43 С 15 мин и продолжают вырашивао ние при 37 С 1 ч с эффективной аэрацией. Лизис клеток завершают добавлением в срецу хлороформа (1/100).

Дальнейшую очистку фага и выделение

ДНК проводят по методике, описанной в этом примере выше.

Полученные препараты ДНК плазмиды

pBR322 lig35 обрабатывают эндонуклеазами рестрикции BamHI а ДНК фага с1857 cro am6 гидролизуют одновременно эндонуклеазами рестрикции

BamHI u BglII. Полученные фрагменты

ДНК плазмиды и фага смешивают в со— отношении 1:10 и соединяют ДНК вЂ лигазой фага Т4 по методике, описанной выше (схема фиг. 3). После трансформации компетентных клеток Е.coli

К802 отбирают клоны с иммунитетом к суперинфицирующему фагу лямбда.

В данном эксперименте используют фаги, перечисленные в табл. 2.

Из клеток клонов, обеспечивающих иммунитет к фагу лямбда, известными методами выделяют плазмидную ДНК, обозначенную нами pILL435 и содержащую в своем составе три фрагмента области иммунитета фага лямбда, которые образуются при совместном гидролизе фаговой ДНК эндонуклеазами рестрикции BamHI u BglII (фиг. 1 и 3).

Анализ генетических маркеров в рекомбинантных плазмидах проводят следующим образом.

Резистентность к ампициллину клеток штамма Е.со11 lig ts7, содержащих плазмиду PILL 435, анализируют на агаризованной среде с содержанием ампициллина от 10 до 100 мкг/мл.

Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина.

Наличие в клетках, содержащих плазму pILL435, репрессора фага лямбда, обусловливающего иммунитет клеток к суперинфицированию гомоиммунными фагами лямбда, устанавливают следующим образом: клетки из отдельных колонов высевают в 1 мл

МПБ и после выращивания до титра

8 8

2 10 — 6-10 кл/мл наносят микробиологической петлей на чашку с твердым агаром в виде полосы; после

5-минутного подсушивания (20"С) аккуратно наносят петлей суспензию различных фагов с титром 1-5х х10 б.е./мл и затем инкубируют

В + при 30 С 6 — 8 ч.

Для проверки наличия репрессора используют фаги 434 imm q, g imm21, Ь, 1ic126, g c1857, Ъ vir, g imm434, а также фаги Т4 и Т4 rII. Результаты исследования даны в табл. 3.

Знаком + отмечены фаги, способные размножаться на анализируемой культуре.

Из результатов, приведенных в табл. 3, следует, что плазмида

pILL435 действительно содержит гены области иммунитета фага лямбда. От— сутствие роста фага Т4 rII на штамме, содержащем плазмиду pILL435, доказывает наличие в плазмиде функ- ционирующего гена rex фага лямбда.

Для анализа одновременного присутствия мутаций в генах cl u cro проводят рекомбинацию in vivo меж1122003 10

5

40 ду плазмидами и фагом g imm434 с+, который образует негативные колонии с мутным центром за счет эффективной лизогенизации.

Штаммы, содержащие плазмиды, выращивают в 10 мл бульона до титра

8 о

1,6х10 кл/мл, при 30 С инфицируют фагом Я imm434 с множественностью

0,1, инкубируют при 30 С 4 ч, добавляют 1/100 часть (об/об) хлороформа и титруют на бактериальных газонах с клетками, содержащими и не содержащими фаг 434 в состбянии профага. Образование рекомбинан тов дополнительно указывает на присутствие регуляторной области фага лямбда cl в гибридных плазмидах рILL435. Гибридный фаг, полученный при рекомбинации с плазмидой pILL435, образует на газоне клеток Е.coli о

С600 при 37 С прозрачные негативные о колонии, а при 30 С вЂ” мутные, что указывает на наличие термочувствительной мутации в гене сl плазмиды

pILL435.

Анализ наличия в гибридных фагах супрессируемой мутации в гене сro проводят сравнением эффективности титрования того фага на штаммах

Е.coli с различными супрессорными мутациями при 30 и 43 С. Результаты о анализа (см. табл. 3) указывают на одновременное присутствие в плазмиде pILL435 мутаций в генах сго и сl, а также на различную степень супрессии этих мутаций в зависимости от типа супрессора, присутствующего в штамме (ОррепЬепп А., Орреп? eim А. В. Virology, 75, 469-476, 1976).

Из данных этой таблипы. следует, что гибридная плазмида PILI,435 действительно содержит фрагмент ДНК фага лямбда с мутациями cl857 и сгоб.

Клетки штамма Е.roli lig сs7 из-за наличия термочувствительной мутации в гене бактериальной лигазы не способны расти при температуре о

43 С. Трансформация клеток E.coli

lig ts7 плазмидой рПЛ 435 и последующие проверки роста трансформаторов при 30, 36, 43 С показывают, что а клетки штамма Е.coli lig ts7, содержащие плазмиду рП,Е435, приобретают способность расти при 43 С. В целом клетки E.coli lig ts7, содержащие рекомбинантные плазмиды

1122003

pILL435, обладают следующими признаками:

Резистентность к ампициллину;

Иммунитет к фагам g cl 26, 3, 4341пнп%, с1857;

Не способны поддерживать размножение фагов T4 rll; о

Способны к росту при 43 С.

Определение активности ДНК-лигазы фага Т4.

0,5 r биомассы E.coli ВКМ В-1449Д суспендируют в 3 мл лизирующего буфера 0,2 М ИаС1, 0,05 М трис-НС1, рН 7,5, 0,001 М восстановленного глютатиона, 100 мкг/мл лизоцима, выдерживают при 0 С 10 ч, озвучивают о ультразвуком 4 раза по 30 с при

0 С, затем центрифугируют (22300g, о

2 ч, О С). Супернатант наносят на колонки с фосфоцеллюлозой Pll (0,5 мл), предварительно уравнове- шенные буфером М (0,2 М NaC1, 0,05 М трис-НС1, рН 7,5, 5 мМ дитиотреитол), промывают этим буфером, фракции с активностью ДНК-лигазы элюируют буфером В, содержащим 0,7 М NaC1.

Элюат собирают по 0,5 мл и в каждой фракции определяют активность ДНКлигазы.

Реакционная смесь (20 мкл) содержит 5 пикомслей Н-АТФ (40 Ки/мМ), з

10 СаС), 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 MM дитиотреитола, 1 мМ ЭДТА и от

2 до 15 мкл отдельных фракций, элюированных с колонки. Пробы инкуби— о руют при 20 С 5 мин. Реакцию останавливают перенесением на фильтр

Mhatman 3 мМ с последующим немедленным погружением фильтра в холодный раствор 5 †но ТХУ с )Е-ным пирофосфатом натрия. После инкубао ции (15 мин при 0 С) раствор сливают, заменяют свежим и выдерживают при 0 С 10 мин. Фильтры промывают последовательно холодной водопроводной водой, спиртом, ацетоном, высушивают на воздухе и просчитывают радиоактивность в сцинтилляционном счетчике. За 1 единицу фермента принимают количество ДНК-лигазы фага Т4, необходимое для образования АМФ-лигазного комплекса с 1 пиэ комолем Н-АМФ. При определении активности в штамме фракции, содержащие фермент, объединяют, разводят пробы и считают активность, учитывая разведение.

Кроме того, уровень синтеза ДНКлигазы фага Т4 анализируют электро5

55 форетически известными методами (Murray N. Е. et al., 3. Mol.Biol., )32, 493-506, 1979) в каждой отдельной и объединенных фракциях элюата (фиг. 4).

Пример 2. Плазмиду pILL435

Формируют в штамм Е coli АА)25 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм-продуцент ДНК-лигазы фага Т4 с активностью не менее

50000 ед/г биомассы клеток.

Для сравнения в табл. 4 приведены значения уровней синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах Е.coli, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435.

Предлагаемые изобретения позволяют получить штамм Е.coli — продуцент ДНК-лигазы фага Т4. Уровень синтеза фермента в предлагаемом штамме E.coli АА125, содержащем рекомбинантную плазмиду pILL435 не менее 50000 единиц на 1 г сырого веса биомассы клеток, что в 10 раз выше уровня синтеза этого фермента в сравнении с лучшим из известных штаммов — Е.со1х ИМ989 (базовый объект, описанный в работе Murray N. Е. et al., J. Mol. Biol., 132, 493, )979). Полученный положи— тельный эффект предлагаемых изобретений достигается за счет свойств сконструированной новым способом плазмиды pILL435 с полным геном

ДНК-лигазы фага Т4. Плазмида pILL435 содержит раннюю область фага hc)857 cro am6, что обеспечивает эффективный регулируемый синтез

ДНК-лигазы фага Т4, осуществляемый под контролем раннего промотора фага лямбда Р1 (см. фиг. )).

В данной плазмиде в отличие от

ДНК фага ИМ989, используемого ранее, отсутствует ген -экзонуклеазы и другие фаговые гены, продукты которых затрудняют последующую очистку целевого продукта. В СССР и в других лабораториях мира для получения ДНК-лигазы до настоящего времени плазмида, определяющая синтез

ДНК-лигазы фага 14, не использовалась.

Предлагаемый способ конструирования плазмид дает возможность получить рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую увеличение синтеза

ДНК-лигазы фага Т4. Использование

HindIII-EcoRV — фрагмента ДНК фага

NM816-1 позволяет выделить полный

1122003

13 но реплицирующаяся система, не нуждающаяся подобно лизогенным фагам в индукции. Поэтому штамм, содержащий данную плазмиду, культивируется при постоянной температуре и не требует ступенчатого изменения температурных режимов при выращивании биомассы клеток.

Таблица 1

Сравнение уровней синтеза ДНК-лигазы бактериофага Т4 в различных штаммах

Е.coli

Активность, ед/г биомассы

Штамм-продуцент

E.coli В, Т4 атп NB2 инфицированный бактериофагом

168

Е.coli 802, содержащий плазмидную

pTPN3012 ДНК (1,9 тпо) E.coli 802, содержащий плазмидную

pBR322 lig 35 ДНК (2,9 тпо) 80

Е.coli NM989

4800

Е.coli АА125, содержащий плазмидрТ1Ь435 ную ДНК (ВКМ В-1449Д) 50000

Определение активности ДНК-лигазы проводилось по методу Кнопфа (см. пример 1), Knopf R.V., Eur. J, Biochem., 73, 33-38, 1977.

Т а блица 2

Анализ генетических маркеров в клетках, содержащих и не содержащих рекомбинантную плазмиду pILL435

g vir у пта121 imm434

Штамм, у которого

Плазмида

pILL435

Плазмида

pILL435 отсутствует +

+ б.е./мл — бляшкообразующие единицы в мл. ген ДНК-лигазы с собственным промотором и расположить его в непосредственной близости от промотора Р1 .

Регуляция транскрипции с данного промотора осуществляется генами регуляторами с 1857 и cro am6, входящими в состав области иммунитета фага % . Плазмида pILL435 — автоном— сI 434пшп 3 Т4 T4rII

16

1122003

Таблица 3

Эффективность титрования фагов лямбда с мутациями в генах репрессоров в различных условиях

43/38

30/38

Бактериофаг

W3350 С600 QD 5003 W 3350 С600 QD5003

1,0 с1857

1,0 1,0

1,0

1,0

1,0

+ о, отношение титров фага при температуре 30 и 38 С;

++ о отношение титров фага при температурах 43 и 38 С.

Т а б л и ц а 4

Уровень синтеза ДНК-лигазы фага Т4 в различных штаммах

Е.coli, содержащих рекомбинантную плазмидную ДНК pILL435

Штамм

Активность ед. Кнопфа

Номер

10000

17000

3 Е.coli 802/pILL435

4 Е.coli С600/pILL435

g c1857 cro am6 0,05 0,47

gimm434 X pILL435 0,052 0,4 0,08

1 Е.coli QD5003/pILL435

2 Е.coli Sul/pILL435

5 Е.coli АА125/рП.Т.435=ВКИ В-1449Д

" Штаммы получены трансформацией плазмиды

pILL435 (см. пример 1).

0,03 0,15

0,05 0,1 0,01

50000

1122003 Оргмоменты QHK:

Е2".:Л фага Т () фагаЛММ816-1

1Sa ZZZ фага ЛС1 857 СВОагаб

ЕсоЯ1

Hind Ill

EcoRl ,Вс1111

co Rl

EcoRV

BamHl

Рит 1 t R 3 A Б G 7 B Я

1122003

1122003

Ъ, 94 К ь >же

67к .";4

Редактор П. Горькова Техред О. Ващишина Корректор Е.Рошко

Заказ 8128/2 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4