Питательная среда для культивирования продуцента мацерирующих ферментов @ @ -31

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА МАЦЕРИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ BACILLUS CiRCULANS-31, содержащая кукурузный экстракт по сухим веществам,углекислый кальций, мочевину, сернокислый калий, свекловичный жом, водопроводную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения биосинтеза, увеличения стабильности пектат-трансэминазы и снижения себестоимости,, в состав среды дополнительно вводят оксигенальное комплексное соединение кобальта (Ц) с углеродсодержащим лигандом, гидроокись калия и сернокислый марганец при следующем соотношении ингредиентов, мас.%; Свекловичный жом 1-4 Гидроокись калия 0,1-0,3 Сернокислый калий 0,1-0,4 Углекислый кальций 0,02-0,3 Мочевина0,2-0,8 (Л Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50% 0,2-1,5 Сернокислый марганец 0,02-0,12 Оксигенальное комплексное соединение кобальта (И) с углеродсодержащим лиган-J дом 0,00030 ,0042 (по металлу) 9) Вода водопроводная Остальное О :д 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) 01) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

0,00030,0042 (по металлу)

Остальное

Вода водопроводная

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

flo делАм изОБРетений и ОчнРытий (21) 3596295/13-28 (22) 23. 05.83 (46) 30,09.84. Бюл. М 36 (72) Г.Б.Бравова, T.E.Ñìèðíîâà, В.В.Бурмистрова, Ю.И.Шишков, Н.М.Макарова, К.A.Êàëóíÿíö, .

A.М.Шапиро, И.Б.Барановский и М;А.Голубничная (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (53) (088.8) (56) 1.Бравова Г.Б.,Калунянц К.A., Гребешкова P.Н., Дуда В.И., Купцова Г.B. Технология культивирования анаэробной бактерии рода Closridium продуцента пектинолитических ферментных препаратов.- Ферменты. Получение и применение в народном хозяйстве . N.. 1974, вып ° 2, с. 71-77.

2.Авторское свидетельство СССР

9 1017728, кл. С 12 N 1/20, 1980 °

3.Авторское свидетельство СССР по заявке М 3486628/28-13, кл. С 12 N 1/22.. С 12 N 9/14, 1982.

4 . Авторское свидетельство СССР

Р 1026405, кл. С 12 N 1/20, 1980, (54)(57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА МАЦЕРИРМОЩИХ

ФЕРМЕНТОВ BACILLUS CiRCULANS — 31, содержащая кукурузный экстракт по

3Ш: С 12 И 1/20; С 12 N 9/00;

С 12 R 1/07 сухим веществам, углекислый кальций, мочевину, сернокислый калий, свекловичный жом, водопроводную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения биосинтеза, увеличения стабильности пектат-трансэминазы и снижения себестоимости,. в состав среды дополнительно вводят оксигенальное комплексное соединение кобальта ((() с углеродсодержащим лигандом, гидроокись калия и сернокислый марганец при следующем соотношении ингредиентов, мас.Ъ:

Свекловичный жом 1-4

Гидроакись калия 0,1-0,3

Сернокислый калий 0,1-0,4

Углекислый кальций 0,02-0,3

Мочевина 0,2-0,8

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50% 0,2-1,5

Сернокислый марганец 0,02-0,12

Оксигенальное комплексное соединение кобальта (fI) с углеродсодержащим лигандом

1116058

0,2-1,5

О, 02-0, 12

О, 1" 0,3

0,00030,0042 (по металлу)

Остальное

Вода водопроводная

Применение оксигенального комплексного соединения кобальта (It) с углеродсодержащим лигандом в составе питательной среды приводит к ин тенсификации биосинтеза мацерирующих ферментов, увеличению роста биомассы и снижению себестоимости конечного продукта при глубинном аэробном культивировании В.circulans-31 — продуцента мацерирующих ферментов вследствие того, что оксигенальное координационное соединение является источником кислорода, так как молекулярный кислород в координационном соединении находится в слабосвязанном состоянии; молекула координационного соединения содержит кобальт, являющийся микроэлементом, необходимым для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов1 углеродсодержащий лиганд является дополнительным источником углерода; в оксигенальном координационном соединении имеются лабильные координированные молекулы воды, которые способны к замещению на другие лиганды, например на донорные атомы азота белковых молекул, аминокислот и т.д., входящих в состав микроорганизмов, что приводит к образованию активного комплекса микроорганизм — координационное соединеМаксимальная активность пектат- 50 транс-элиминазы на питательной среде указанного состава составляет

60 ед/см (4) .

Изобретение относится к микробиоогической.промышленности и может

ыть использовано при производстве мацерирунщих ферментов, применяемых в первичной обработке лубоволокнис- . тых культур, например льна и коноп- 5 лие

Известна питательная среда для биооинтеза пектолитических ферментов анаэробной бактерии Clostridium

pectinofermentans 15 s процессе ее 10 глубинного культивирования 113 .

Активность пектат-транс-элиминазы (ПТЭ) на этой среде составляет

0,6-1,0 ед/см, эндо-полигалактурона3 за (эндо-ПГ) не синтезируется.

Недостатком этой питательной сре» ды является низкий уровень ПТЭ и отсутствие синтеза эндо-ПГ.

Известна питательная среда для глубинного культивирования продуцентов пектолитических ферментов. Активность ПТЭ при культивировании

В.circulans-31 в анаэробных условиях на 30-м часу культивирования составляет 16 4 ед/см, эндо-ПГ— . 6 ед/см (21.

Недостатками указанной питательной среды являются низкий уровень биосинтеза пектолитических ферментов и значительное время культивирования.

Известна также питательная среда для культивирования микроорганизмов — продуцентов пектинолитических ферментов, содержащая оксигенированное соединение кобальта с азот- 35 содержащим лигандом, добавление которого приводит к увеличению активности ферментов (3) .

Наиболее близкой к предлагаемому по технической сущности и достигае- 40 мому положительному эффекту является питательная среда для биосинтеза мацерирующих ферментов, содержащая: щелочной гидролизат свекловичного жома 50 r. 2,6-8Ъ-ного раствора, кукурузный экстракт 0,4-2,0; мочевина 45

0,3-1; кальций углекислый 0,05-0,5; калий сернокислый 0,05-0,3; вода водопроводная остальное.

Однако данная питательная среда имеет недостаточно высокий уровень синтеза ПТЭ - фермента, ответственного за мацерацию растительной ткани. В составе питательной среды используется щелочной гидролизат свекловичного жома, для приготовле- 60 ния которого необходимы дополнительные операции по проведению гидроли.эа, что значительно удлиняет про цесс приготовления питательной среды °

Цель изобретения - повышение биосинтеза, увеличение стабильности ПТЭ и снижение себестоимости.

Поставленная цель достигается тем, что в питательную среду для культивирования продуцента мацерирующих ферментов Bacillus circulans-31, содержащую кукурузный экстракт по сухим веществам, углекислый кальций, мочевину, сернокислый калий, свекловичный жом и водопроводную воду, дополнительно вводят оксигенальное комплексное соединение кобальта (П) с углеродсодержащим лигандом, гидроокись калия и сернокислый марганец при следующем соотношении ингредиентов, мас.Ъ:

Свекловичный жом l-4

Сернокислый калий 0il-0,3

Углекислый кальций 0,02-0,3

Мочевина 0,2-0,8

Кукурузный экстракт, при содержании сухих веществ 40-50%

Сернокислый марганец

Гидроокись калия

Оксигенальное комплексное соединение кобальта (П) с углеродсодержащим лигандом

1116058 ние кобальта. Эта система является активатором процесса ферментаций.

В отличие от прототипа в предлагаемой питательной среде в качестве источника углерода используется свекловичный жом, для гидролиза которого в состав среды дополнительно вносят гидролизующий агент — гидроокись калия, которая одновременно является дополнительным источником калия.

Гидролиз свекловичного жома под действием гидроокиси калия проходит в момент стерилизации питательной среды, что исключает дополнительные операции по приготовлению щелочных (5 гидролиэатов.

В предлагаемой питательной среде используют сернокислый марганец как источник марганца и стабилизатора ПТЭ., 20

Культивирование В.circulans-31 во всех примерах проводили в колбах емкостью 0,8 л, К заполнения 0,4, при температуре 40 С и аэрации на качалке 180 об/мин, доза посевного материала 5%, в течение 10-18 ч.

Пример 1. Предлагаемая среда, мас.%: .Свекловичный жом

Гидроокись калия

Углекислый кальций

Мочевина

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ

40-50% 0,2

Сернокислый марганец 35

Оксигенальное соединение кобальта (И) с углеродсодержащим лигандом—

0,1

0,2 имидазолом 0,0003 (по метал- 40 лу)

Вода водопроводная Остальное

Активность ПТЭ к 14 ч роста в культуральной жидкости достигла

640 ед/см (активность ПТЭ определя- 45 ли прямым спектрофотометрированием при длине волны 230-235 нм; за единицу активности принимается такое количество фермента, которое катализирует расщепление субстрата до образования 1 ммоля дигалактуроновой кислоты), активность экзо-полигалактуроназы (экзо-ПГ) достигла

58 ед/см (активность экзо-ПГ опре3 деляли титрометрическим методом по увеличению количества восстанавливающих альдегидных групп (ГОСТ

20264,3-81); активность эндо-ПГ достигла 2 ед/см (активность эндо-ПГ определяли вискозиметрическим методом ГОСТ 20264,3-81); титр клеток 60 составил 2,7 10 (титр клеток определяли методом предельных разведений) .

Пример 2. Предлагаемая среда, мас.%: 65

Свекловичный жом

Гидроокись калия

Сернокислый калий

Углекислый кальций

Мочевина

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50%

Сернокислый марганец

Оксигенальное соединение кобальта с лигандом - имидазолом

2,75

0,2

0,2

0 25

0 5

1,25

0,1

При определении стабильности ПТЭ, полученной в результате культивирования В.circulas 31 на предлагаемой питательной среде, проведено определение активности ПТЭ после 1-4 сут хранения культуральной жидкости при комнатной температуре. Контролем служила культуральная жидкость, полученная на питательной среде прото0,0024 (по металлу)

Вода водопроводная Остальное

Активность ПТЭ к 10-му часу культивирования достигла 890 ед/см, экзо-Пà — 71 ед/см, эндо-ПГ 5 ед/см, титр клеток 1,8 10 .

Пример 3. Предлагаемая среда, мас.%:

Свекловичный жом 4

Гидроокись калия 0,3

Сернокислый кальций 0,4

Углекислый калий 0,3

Мочевина 0,8

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50% 1,5

Сернокислый марганец 0,12

Оксигенальное соедйнение кобальта с лигандом — имидазолом 0,0042 (по металлу)

ВоДа водопРоводнаЯ Остальное

ПТЭ на 16-ом часу культивирования достигла 670 ед/см, экзо-ПГ 80 ед/cM зндо-ПГ-3 ед/см, титр клеток 1,2х10 .

Пример 4 ° Предлагаемая среда, мас.%:

Свекловичный жом 1

Гидроокись калия 0,1

Углекислый кальций 0,02

Мочевина 0,2

Кукурузный экстракт при содержании сухих веществ 40-50% 0,2

Сернокислый марганец 0,02

Оксигенальное соединение кобальта с лнгандомэтилендиамином 0,0003 (по металлу)

Вода водопроводная Остальное

ПТЭ на 18-ом часу культивирования достигла 652 ед/см, экзо-ПГ

51 ед/см, эндо-Пà — 3 ед/см, титр клеток 1уз 10в

1116058

Составитель Ф.Кононков

Редактор Т.Веселова Техред д. Микеш Корректор Г.Решетник

Эакаэ 6865/20

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4 тира. В контрольном опыте получены следующие.результаты: после 1-х суток хранения культуральной жидкости падения ПТЭ не отмеченоу на 2-е сутки падение ПТЭ активности на 20%у иа 3-и сутки падение ПТЭ активности иа 27Ву на 4-е сутки падение ПТЭ активности на 42%.

Пример 5. Состав среды ана- логичен составу среды примера 1.

После 2-х сут хранения культуральной жидкости изменения ПТЭ активности не отмечено, на 3-и сутки падение активности ПТЭ на 10%; на 4-е сутки на:17% е

Пример 6. Состав среды анало-15

Гичен составу среды примера 2. После

2 сут хранения культуральной жидкости изменение ПТЭ активности не отмечено на 3-и сутки падение активнос ta на 5%у на 4-е сутки - на 8Ъ. .Пример 7 ° Состав среды ана.логичен состау среды примера 3.

После 2-х суток хранения культуральной жидкости изменение ПТЭ активности не отмечено, на 3-и сутки падение активности на 65, на 4-е суткина 11аь

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования

В.circulans-31 - продуцента мацери-, рующих ферментов имеет по сравнению с прототипом следующие преимущества: увеличение ПТЭ активности в культуральной жидкости в 10-15 раз; достижение активности экзо-ПГ до 60-80 ед/см ; достижение активности эндоПГ до 3-8 ед/см ; увеличение роста

3 биомассы - титр клеток достигает до 1,8 ° 10; повышение стабильности

ПТЭ в 2 3 раза, что приводит к снижению себестоимости конечного продукта на 1761,0 руб.

В качестве базового объекта принята питательная среда для производства мацерирующего, 4ерментного препарата. Мацеробациллин ГЗх на

Омутнинском химзаводе.

Технико-экономические показатели базового объекта: активность ПТЭ

350+50 ед/см ; себестоимость конечного продукта 5653,7 руб.

Технико-экономические показатели предлагаемого технического решения: активность ПТЭ 890 ед/см ; себестоимость конечного продукта 3892,7 руб °

Ожидаемый экономический эффект от применения предлагаемой питательной среды составляет 79,8 тыс.руб.