Способ выделения тироксинсвязывающего глобулина
СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ТИРОКСИН ,СВЯЗЬВАЮЩЕГО ГЛОБУЛИНА из сыворотки Клч-v 13 13 Ttrv.- .-.л 5й5сй 1« р :. крови путем хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повьппения выходабелка, хроматографию осуществляют на сорбенте,представляющем собой матрицу, ковалентно связанную с тироксином, с последую- . щей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем раствором холата натрия , элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
- (59 4 . С 07 G 7/00 фЯ Р Щ Р 1Я
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ABTOPCHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТБУ
@ y., 11 Î ":
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3586244/28-13 .(22) 26.04.83 (46) 15.07.86. Бюл. У 26 (71) Институт биоорганической химии
АН БССР (72) И.Н.Ермоленко, О.В.Свиридов, В.Л.Чащин, О.А.Стрельченок и А.А.Ахрем (53) 615.361.018.53 (088.8) (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТИРОКСИН- ., . СВЯЗЫВАЮЩЕГО ГЛОБУЛИНА из сыворотки
„„SU„„1 I 28569 A с крови путем хроматографии, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода белка, хроматографйю осуществляют на сорбенте,представляющем собой матрицу, ковалентно связанную с тироксином, с последующей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем раствором холата натрия, элюцией белков раствором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере.
1128569
l0
30
35 рий-фосфатным буфером (pH 7,0). Гомогенный ТСГ элюируется в стартовом ,буфере. Гидроксиаппатит регенерируют що промывкой 0,1 М натрий-фосфатным буДальнейшую очистку полученного аффинного алюата от альбумина осуществляют на конканавалин-А-сефарозе в 0,05 М трис-НС, буфере (рН 7,4).
TCI" элюируется 0,03 М раствором
4:-метил-D -маннозида в 0,05 M трисНС буфере (рН 7,4). Общий выход
ТСГ составляет 60Х.
Основными недостатками способов являются не высокий выход целевого продукта и получение его в комплексе с природным лигандом - тироксином, что может затруднить его дальнейшее использование. 50
Целью изобретения является повышение выхода белка.
Поставленная цель достигается тем, что в способе вьщеления тироксин, связывающего глобулина из сыворотки крови путем хроматографии, хроматографию осуществляют на сорбенте, представляющем собой матрицу, кова55
Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к выделению тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ),который может быть использован в качестве компонента диагностических наборов для определения ТСГ в крови человека.
Известен способ выделения белковой смеси, связывающий тироксин, заключающийся в инкубации сыворотки или .плазмы крови человека с тироксином, ковалентно связанным с сефарозой, OTMblBKe тироксин-сефарозы бикарбонатным буфером и элюции целевого продукта раствором щелочи. Целевым продуктом является белковая смесь, содержащая кроме ТСГ и другие тироксинсвязывающие белки (альбумин и преальбумин), с выходом до 90Х по ТСГ.
Наиболее близким техническим .решением является способ выделения
ТСГ, заключающийся в аффинной хроматографии плазмы крови человека на трииодтиронинсефарозе. После отмывки матрицы от неспецифически связанных белков О, 1 М барбиталовым буфером (рН 8,6), содержащим 1 М NaCьв 0,1 М трис-НС t буфере (рН 8,6), содержащим
2 М NaCf. в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 6,8) и содержащим 2 М
NaC В в О, 1 М трис-НС Е буфере (рН
8,6), элюцию целевого продукта осуЩествляют раствором тироксина (100 мг/л) в 0,1 М трис-НСЙ буфере (рН 8,6). лентно связанную с тироксином, с последующей промывкой сорбента бикарбонатным буфером, затем раствором холата натрия, элюцией белков раст вором щелочи при рН 9,3-12 и очисткой элюата на гидроксиапатите в натрий-фосфатном буфере.
1 л ретроплацентарной сыворотки перемешивают в течение 6 ч при 18 С со 100 мл аффинного сорбента, содержащего 1 мкмоль коньюгированного тироксина на 1 мл сефарозного геля, что создает концентрацию тироксина
1.10 " М. Аффинный сорбент отделяют . путем фильтрования суспензии на пористом фильтре и промывают 1,5 л
О, 1 М NaHCOy (рН 8,6) . Гель переносят на колонку с пористым стеклянным фильтром и отмывают 100 мл 12 мМ раствора холата натрия, а затем 0,1 М раствором NaHCO> (рН 8,6) до получения элюата с постоянной плотностью на 280 нм. Элюцию целевого продукта осуществляют при комнатной температуре 0,001 М NaOH (рН 10,8). Выход
ТСГ составляет 36 мг или 90#..
Хроматография на гидроксиаппатиъе.
Полученные из ретроплацентарной сыворотки 45 мг аффинного элюата, содержащего 80Х ТСГ в 20 мл щелочного раствора, диализуют против 0,005 М, натрий-фосфатного буфера (рН 7,0) и разделяют на две порции по 10 мл.
Одну порцию аффинного элюата наносят на колонку с 15 мп гидроксиаппатита, уравновешенную 0,005 М натфером, а затем 0,005 М натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) и наносят вторую порцию. Количество выделенного ТСГ составляет 30 мг или 84Х. Общий вы- . ход от содержания ТСГ в стартовой сыворотке составляет 75Х.
Полученный данным способом препарат ТСГ содержал одну белковую полосу при электрофорезе в 5 и 7,5Х-ном полиакриламидном геле (ПААГ) при рН 7,0, 8,3, 9,5.. Электрофорез в ПААГе в присутствии додецил сульфата натрия (SDS) также дал одну белковую полосу. При гель-фильтрации препарата на сефадексе 6-100 был получен один симметричный пик.
1128569
Корректор Е.Сирохман.Заказ 3933/2 Тирак 343 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ушгород, ул. Проектная, 4
Молекулярная масса, полученная с помощью гель-фильтрации и SDSфореза, составляла 54000-55000 Д.
Константы ассоциации ТСГ с тироксином и трииодтиронином при 25 С 5
9 В «1 .имеют величины 2,5. 10 и 2,0 10 М,. соответственно. Аминокислотный и моносахаридный составы хорошо корре-" лируют с данными других авторов °
Редактор П.Горькова Техред M.Õîäàíè÷
Полученные физико-химические характеристики позволили судить î гомогениости препарата, полученного данным способом. . Способ гарантирует двухстадийное выделение гомогенного ТСГ с высоким выходом и хорошей воспроизводимостью, при этом выход белка повышается с
60 до 80"85Х.
