Способ получения @ н- и @ с-меченых 11 @ -оксистероидов прегненового ряда
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н- и С-МЕЧЕНЫХ 11 /J-ОКСИСТЕРОИДОВ ПРЕГНЕНОВОГОРЯДА ,включающий трансформацию соответствующего радиоактивного 11 -дезоксистероида с помощью системы, содержащей иммобилизованные на сефарозе адренодоксин, 11 гидроксилирующий цитохром Р-450, адренодоксинредуктазу и НАДФ-Н - регенерирующую систему, содержащую НАДФ-Н, глюкозо-6фосфат и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, проводят реконструкцию мультиферментной системы при соотношении белковых компонентов 88-118 нмоль адренодоксинредуктазы:220 нмоль адренодоксина:28-35 нмоль цитохрома Р-450, осуществляемую путем сорбции цитохрома Р-450 и адренодоксинредуктазы в обьеме адренодоксин-сефаро- .-; зы.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3514146/13 (22) 22.11.82 (46) 30.12.92. Бюл. М 48 (71) Институт биоорганической химии АН
БССР (72) С.П. Марцев, И.А. Беспалов, В.Л. Чащин и А.А. Ахрем (56) Ахрем А.А. и др. Самосборка 11Р-стероидгидроксилирующей системы из митохондрий коры надпочечников, Биооргакическая химия. 1979, т.5, М 6, с.937-939. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н- и С-МЕЧЕНЫХ 11 Р-ОКСИСТЕРОИДОВ ПРЕГНЕНОВОГО РЯДА, включающий трансформацию соответствующего радиоИзобретение относится к биохимии, конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактивномеченого кортикостерона и кортиэола и может найти применение для синтеза радиоактивномеченых стероидных гормонов глюкокортикоидного и минералокортикоидного ряда, необходимых при создании медицинских радиодиагностических наборов.
Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения Н- и С-меченых 11
Р-оксистероидов прегненового ряда, включающем трансформацию соответствующего радиоактивного 11 -деэоксистероида с помощью системы, содержащей иммобилизованные на сефароэе адренодоксин, 11
Р-гидроксилирующий цитохром Р-450, адре„„5Q„„1132544 А1
Способ осуществляют следующим образом.
Заявляемый способ включает ковалентную иммобилизацию адренодоксина и получение адренодоксин-сефарозы с емкостью около 280 нмоль иммобилизованного белка на 1 мл уплотненного сорбента. Насыщение
1132544 сор бента цитохромом P-450 проводили с помощью бэтч-варианта сорбции, что включает в себя инкубацию всего объема сорбента с цитохромом Р-450. Данный способ сорбции белка в отличие от метода фронтальной хроматографии, использованного в прототипе, обеспечивает равномерное распределение молекул во всем объеме аффинного сорбента. Бэтч-адсорбцию цитохрома Р 450 повторяли 4-5 раз, что позволяет сорбировать до 40 нмоль цитохрома P 450 на 1 мл адренодоксин-сефарозы. Бэтч-адсорбцию адренодоксинредуктазы проводили путем однократной инкубации раствора флавопротеида с адренодоксин-сефарозой, содержащей цитохром P-450, что позволяет достигать величин 120-160 нмоль сорбированной адренодоксинредуктазы на 1 мл аффинного сорбента (70 — 80 от максимальной емкости сорбента в отношение адренодоксинредуктазы.
Реконструированную таким образом мультиферментную систему использовали для ферментативной трансформации 11-дезоксистероидов прегненового ряда. Для этого адренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней белками набивали в колонку и через полученный колоночный реактор пропускали буферный раствор, содержащий компоненты НАДФ-Н-генерирующей системы (НАДФ-Н, глюкозо-6-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу), а также расТ8ор 11-дезоксистероида с добавкой Нз либо С-меченого соответствующего стеро1 ида.
Количественное определение продуктов реакции показало, что использованный в заявляемом способе метод бэтч-адсорбции и измененное количественное соотношение белков позволяет значительно увеличить каталитическую эффективность системы, что выражается в увеличении процента трансформации стероидов, увеличении валового выхода продукта и особенно в увеличении выхода продукта в расчете на 1 нмоль активного компонента мультиферментной системы — цитохрома Р-450. Данный эффект обусловлен тем, что в заявляемом способе условия реконструкции и количественные соотношения белковых компонентов мультиферментной системы обеспечивают условия для равномерного распределения реакционных центров 11Р ãèäðîêñèëèðîâàíèÿ во всем объеме сорбента и пространственного сближения центров электронного переноса от адренодоксинредуктазы к адренодоксину и от адренодоксина к цитохрому Р-450. 8 отличие от этого в способе реконструкции мультиферментной системы, описанном в прототипе, в результате использования несбалансированных количеств адренодоксинредуктазы и цитохрома P-450 создаются условия для пространственного разделения зон сорбции адренодоксинредуктазы и цитохрома
P 450, что снижает концентрацию активных центров 11 /З-гидроксилирования.
Пример 1. Для ковалентно-сорбционной реконструкции мультиферментной 11 Р10 гидроксилазной системы используют гомогенные белковые компоненты этой системы — адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром Р-450, выделенные иэ митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота.
Ковалентной иммобилизацией адренодоксина на CNBV-активированной сефарозе получают аффинный сорбент адренодоксин-сефароэу, содержащую 220330 нмоль иммобилизованного адренодок20 сина на 1 мл уплотненного геля.
Сорбцию цитохрома проводили следующим образом. Раствор с концентрацией цитохрома Р-450 20-30 мкМ в 0,05 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содер2- 1 жащем 0,3;6 холата натрия, 2 М KCl, 0,05 твина 20 и 20 мкМ 11-дезоксикортикостерона, разводили в 25-30 раз 0,01 M натрийфосфатным буфером, содержащим 10 мкМ
11-дезоксикортикостерона и инкубировали
30 40 мин при 0 C адренодоксин-сефарозой из расчета 15 мл раствора цитохрома Р-450 (10-15 нмоль гемопротеида) на 1 мл адренодоксин-сефарозы.Затем сорбент осаждали центрифугированием при 2000gx2 мин,супернатант удаляли и процедуру сорбции цитохрома повторяли еще 3-5 раз с новыми порциями раствора белка.
Для сорбции адренодоксинредуктазы раствор с концентрацией флавопротеида 340 4 мкМ в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 10 мкМ 11-дезоксикортикостерона, инкубировали 20 мин при
0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета
10 мл раствора флавопротеида(30 — 40 нмоль
45 белка) на 1 мл адренодоксин-сефарозы. Суспензию сорбента центрифугировали при
2000gx2 мин и супернатант с несорбированным белком удаляли.
Количества сорбированных белков on50 ределяли как по убыли белков в супернатанте, так и после экстракции сорбированных белков с аликвоты адренодоксин-сефарозы.
Уплотненную адренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней флавопротеидами
55 и цитохромом P-450 суспендируют в 0,01 М натрий-фосфатном буфере фН 7,4), содержащем 10 мкМ 11 -дезоксикортикостерон и набивают в колонку диаметром 8 мм. Для проведения 11 Р-гидроксилазной реакции
1132544 через реконструированную таким образом мультиферментную систему пропускают фосфатный буфер, содержащий 11-дезоксикортикостерон с добавкой 11-дезокси(1а, 2а (n)- Н)-кортикостерона и компоненты з
НАДФ-Н-регенерирующей системы:
НАДФ-Н, глюкозо-6-фосфат-дегидрогенаэу. Скорость тока раствора — 1,5 мл/ч, температура-20 С. Элюат собирают порциями по 0,75 мл с помощью коллектора фракций и во фракциях количественно определяют соотношение субстрата и продуктов реакции. Для этого стероиды экстрагируют 6 мл этилацетата, упаривают при температуре не выше 45 С и разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с за-крепленным слоем силикагеля, используя в качестве элюента систему бензол:ацетон (13:7). Процент трансформации субстрата определяли по формуле; 100хВ/(А+В+С), где А— радиоактивность в пятне субстрата реакции,  — радиоактивность в пятне основного продукта реакции, а С вЂ” радиоактивность в пятнах побочных продуктов реакции.
Колоночный реактор, использованный для трансформации Н-меченого 11 -дезокз сикортикостерона, содержал 0,8 мл уплотненной адренодоксин-сефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина, 100 нмоль адренодоксинредуктазы и 32 нмоль цитохрома P-450). Элюционный раствор содержал 0,01 М натрий-фосфатный буфер (рН
7,4), 100 мкМ 11-дезоксикортикостерона с добавкой соответствующего Н-меченого з субстрата в концентрации 1,5 мкКи/мл, 3 мМ НАДФ-Н, 5 мМ глюкозо-6-фосфат и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу в количестве
2,5 единицы на 1 мл раствора, Образованный продукт ферментативной трансформации 11-дезоксикортикостерона — кортикостерон очищен с помощью тонкослойной хроматографии и идентифицирован на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом кортикостерона в различных системах растворителей. Радиохимическая чистота пол° ученного. кортикостерона составляла 96%.
Пример 2. Иллюстрирует ферментативную трансформацию С-меченого 11-де14 . зоксикортикостерона в С-кортикостерон.
14
Реконструкцию мультиферментнои системы и ферментативный цикл проводили, как описано в примере 1, заменяя Н-меченый з
11-дезоксикортикостерон на (4- Cj-11-де14 зоксикортикостерон (0,1 мкКи/мл). Колоночный реактор в этом случае содержал 0,8 мл уплотненной адренодоксинсефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 88 нмоль адренодоксинредуктазы и
28 нмоль цитохрома Р-450.
Радиохимическая чистота продукта составила в этом случае 95 .
5 Пример 3. Ферментативная трансформация Н-меченого 11-дезоксикортизоз ла в Н-меченый кортизол. Приготовление колоночного реактора и цикл ферментативной трансформации проводили согласно
10 примеру 1. В качестве субстрата реакции использовали 11-дезоксикортизол с добавкой 11-деэокси(1,2 . - Н}.кортизола (1,2 мкмКи/мл). Колоночный реактор содержал
0,8 мл адренодоксин-сефарозы (220 нмоль
15 иммобилиэованного адренодоксина), 96 нмоль адренодоксинредуктазы и 31 нмоль цитохрома P-450.
Радиохимическая чистота продукта реакции, идентифицированного на основании
20 сравнения его хроматографических подвижностей с подвижностями кортизола в несколькихсистемах растворителей, составила 97ф,.
Пример 4. Иллюстрирует ферментативнуютрансформацию С-меченого 11-дезокси14
25 кортикостерона в С-меченый кортизол.
14
Реконструкцию мультиферментной системы и ферментативный цикл проводили согласно примеру 1, используя в качестве субстрата 11-дезоксикортикол с добавкой
30 (4- Cj-11-дезоксикортизола (0,1 мкКи/мл).
Колоночный реактор содержал 0,8 мл адренодоксинсефароэы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 118 нмоль адренодоксинредуктазы и 35 нмоль цитох35 рома P-450.
Радиохимическая чистота полученного С-кортизола составляла 96 .
В таблице приведено сравнение каталитических эффективностей реконструиро40 ванных мультиферментных систем в заявляемом способе ферментативной трансформации и в прототипе. ПОскольку основным компонентом мультиферментной системы, содержащим каталитический
45 центр 11Р-гидроксилирования, является цитохром P-450, параметры каталитической эффективности системы нормированы к 1 нмолю цитохрома. Из данных таблицы следует, что заявляемый способ ферментатив50 ной трансформации в 2,8 — 3,1 раза более эффективен для 1 1Р-гидроксилирования 11дезоксикортикостерона и в 2,3-2,5 раза— для трансформации 11-дезоксикортизола.
При этом увеличивается процент трансфор55 маций субстрата — до 757; для 11-дезоксикортиэола и до 62 — для
11-дезоксикортизола по сравнению с прототипом (40-507 в обоих случаях). Общее количество 11Р-оксистероидов. полученное за
1132544 с прототипом в 5,7-6,3 раза для кортикостерона и в 3,1-3,5 раза для кортизола.
1 цикл трансформации в расчете на 1 нмоль цитохрома Р-450, возрастает по сравнению
Параметр
Гидроксилирование
11-дезоксикортикостерона
Прототип
Гидроксилирование
11-дезоксикортизола
Н-меченого
С-меченого
Н-меченого
С-меченого
25:1400:60 100:220:32 (0,4:23,3;1) (3,1:6,9:1) 88:220;28 (3,1:7,9:1) 96:220:31 (3,1:7.1:1) 118:220:35 (3,6:6,7;1) 677
639
360 450
540
616
22,8
21,2
6,8-7,5
17,4
17,6
750
360-450 1356
1290
856
42,4
6,8-7,5
46,1
24,2
60
* - Расчет произведен на одно и то же количество субстрата, поданного в колоночный реактор (900 нмоль).
Редактор Л,Письман
Заказ 571 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул.Гагарина. 101
Количество белковых компонентов s реконструированной системе -адренодоксинредуктаза: адренодоксин: цитохром
P-450
* Выход 11 ф -оксистеро ида: суммарный,нмоль в расчете на 1 нмоль цитохрома P 450, нмоль/нмоль
B ыход 11 Р-оксистероида эа полный реакционный цикл: общее количество и родуктэ,нмоль количество в расчете на 1 нмоль цитохрома Р-450. нмоль/нмоль
* Трансформация субСоставитель А.Павлова
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Э.Лончакова
