Способ выделения и очистки бактериальной надн-дегидрогеназы

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ НАДН-ДЕПЩРОГЕНАЗЫ путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы , экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью получения НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона, в качестве штамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569В , дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дезинтегрант замораживают при минус 18-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при. комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000 на холоду, надосадочную жидкость пропускают через колонку с сеАадексом G-200 при температуре и элюируют целевой продукт 0,01 М K/Na фосфатным буфером рН 7,7-7,9.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ социалистических геспжлин (1)4 С 12 N 9/00 (2)) 3602978/28-13 (22) 07.07.83 (46) 30.09.85. Бюл. 1Ф 36 (72) Н;Г.Тихонов, Т.А.Коткина и А.К.Адамов (53) 615.779.94(088.8) (56) Жукова И.Г., Шапошников Г.Л., Островский Д.Н. "Белки бактериальных мембран. Очистка НАДН-дегидрогеназы из N.lysodeikticus с помощью электрофокусировки". — "Биохимия", 1975, т. 41, в. 10, с. 1840-1845. (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ НАДН-ДЕГИДРОГЕНАЗЫ путем культивирования штамма-проду цента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной био„„SU„„1136479 А массы, экстракцией и хроматографической очисткой .целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью получения НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона, в качестве штамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569 6, дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дезинтегрант замора>кивают при минус 18-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при, комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000 g на холоду, надосадочную жидкость пропускают через колонку с сейадексом С вЂ 2 о при температуре 4-6 С и элюируют целевой продукт 0,01 М К/Ма фосфатным бу— фером рН 7,7-7,9.

1136479

Изобретение относится к области микробиологии и касается получения

НАДН-дегидрогеназы из микроорганизмов.

Известен способ выделения и очист- 5

KH бактериальной НАДН-дегидрогеназы, например М.lysodeikticus, путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта (1).

Однако известный способ не обеспечивает получение НАДН-дегидрогенаэы холерного вибриона.

Целью изобретения является получение НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона.

Эта цель достигается тем, что в способе выделения и очистки бактери- 20 альной НАДН-дегидрогеназы путем культивирования штамма-продуцента в питательной среде с последующей дезинтеграцией полученной биомассы, экстракцией и хроматографической очисткой целевого продукта в качестве шгамма-продуцента используют холерный вибрион штамм 569 В, дезинтегрирование проводят в смеси с кварцевым песком, полученный дез- 30 интегрант замораживают при минус

",8-20 С в течение 18-24 ч, оттаивают при комнатной температуре, центрифугируют при 8000-10000 g на холоду, надосадочную жидкость пропускают З5 через колонку с сефадексом G-200 при о температуре 4-6 С и элюируют целевой продукт 0,01 M K/Nà фосфатным буфером рН 7,7-7,9.

Пример. В качестве продуцен- 40 та используют холерный вибрион классического биовара, серовара Инаба штамма 569 В, который хранится в коллекции музея живых культур института "Микроб". Культуру штамма-проду-45 о цента выращивают при 34-36 С в течение 10 ч в 250 л реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом на бульоне из Лерментативного гидролизата казеина рН 8,0, содержа- 5р щего 200 мг Ж аминного азота, 2 пептона, 0,5Х NaC1, 0,05X Na PO . Бульон- ную реакторную культуру холерного .вибриона инактивируют 0,67 формалина, время экспозиции 16-18 ч. Отделение бактериальных клеток проводят проточным центрифугированием при

10000-12000 q . Биомассу подвергают механической дезинтеграции путем растирания ее в смеси с кварцевым песком в течение 30 мин (на одну часть биомассы берется семь частей кварцевого песка). Дезинтегрированные клетки холерного вибриона отделяют от кварцевого песка декантацией.

Разливают небольшими порциями в кол-. бы объемом по 0,5-1,0 л на 18-24 ч помещают в низкотемпературный рефрижератор при минус 18-20 .С для замораживания. Затем замороженный дезинтеграт вынимают из рефрижератора и оставляют при комнатной температуре на 5-6 ч. При оттаивании образуется нерастворимый гелеобразный осадок (флокулят) и жидкая фракция. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при 8000- 10000 ч. в течение

30-40 мин при 1-2 С. Полученную при этом прозрачную опалесцирующую надосадочную жидкость (уже частично освобожденную от белково-нуклео-полисахаридных компонентов) очищают с помощью гельхроматографии. Хроматографическую колонку размером 50- 2,0 см, имеющую систему охлаждения, напол1 няют сефадексом 6-200. На гель сефадекса наносят надосадочную жид— кость, содержащую НАДН-дегидрогеназу.

В качестве элюирующей жидкости используют 0,01 M К/Na-Лосфатный буфер рН 7,7-7,9. Элюцию фермента проводят со скоростью 21 мл/ч. Фракции объемом

5/6 мл собирают на .автоматическом коллекторе. Каждую фракцию испытывают на содержание белка (по поглощению длины волны 280 нм и более точно по методу Лоури) и на активность

НАДН-дегидрогеназы.

Все операции по выделению НАДН-де. гидрогеназы проводят на холоду при

4-6 С и под контролем определения о удельной активности фермента. Активность НАДН-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически по скорости восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДФИ) в инкубационной смеси, состоящей из 0,00012 М НАДН-Na,, 0,00012 М 2,6-ДФИ и 0,5 M трис-НС1 буферарН 7,6.0 скорости восстановления

2,6-ДФИ судят по снижению оптической плотности инкубационной смеси пос" ле добавления ферментного препарата через 30 с в течение 3 мин. Оптическую плотность определяют при длине волны 600 нм. Активность НЛДН136479 4 ности ферментного препарата к концентрации белка в нем рассчитывают удельную активность фермента. дегидрогеназы выражают в условных единицах. За условную единицу принимают то количество фермента, которое способно понизить оптическую плотность инкубационной смеси на

0,01 цены деления шкалы спектрофотометра СФ-26 за 1 мин. Путем отношения HAJH-дегидрогеназной активВеличина удельной активности НАДН-дегидрогеназы холерного вибриона на различных этапах выделения и очистки

Удельная активность усл/ед/мг

Степень очистБелок, мг/мл

Активность, усл.ед.

Статистический,Этап выделения ки показатель

Исходный препарат (дезинтегрант биомассы Vibrio

cholerae 569 B)n=4

33 +7,96 10 +2,17 0,32 +0,05

И «m

8,2. 10,56 21-,0И,67 2,35 4 0,2 7,3

М+ш

Второй этап выделения (хроматография на сефадексе . ф-200)

n=10

2,17 t 0,33 12,3+1,74 5,72 0,4

17,8

М+ш

0,44

0,002 (0,001

Из 100 r биомассы вибриона классического биовара, серовара Инаба штамма 569 В получают 1,12 г.ферментного белка.

НАДН-дегидрогеназа обладает антигенными н иммуногенными свойствами, Корректор М.Демчик

Редактор О.Филиппова Техред С.Мигунова, Заказ 6646/4 Тираж 524

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, Москва, R-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Первый этап выделения (замораживание и оттаивание дезинтегранта) п-10

Результаты определения удельной

НАДН-дегидрогеназной активности на всех этапах выделения фермента представлены в таблице.

0,009 0,002 (0,001 что позволит использовать данный .препарат для конструирования вакцины.

40 Использование способа позволяет простым методом получить ферментный препарат НАДН-дегидрогеназу холерного вибриона высокой степени очистки.