Штамм гриба @ @ 3 @ -106-продуцент целлюлазы

Авторы патента:

БЕЗБОРОДОВ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

БАРТОШЕВИЧ ЮРИЙ ЭДУАРДОВИЧ

ЗАГУСТИНА НАТАЛИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ЛЕБЕДЬ ЭЛЬГА СТЕПАНОВНА

ШИШКИНА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ТИУНОВА НАТАЛИЯ АНДРЕЕВНА

РОДИОНОВА НАТАЛИЯ АРСЕНЬЕВНА

C12R1/645 - Схема кодирования для подклассов C12C-C12Q или C12S, относящаяся к микроорганизмам

C12N9/42C12N15 - Ферменты, например лигазы (6.); проферменты; композиции их (препараты для чистки зубов, содержащие ферменты A61K 7/28; лекарственные препараты, содержащие ферменты или проферменты A61K 38/43; составы моющих средств, содержащих ферменты C11D); способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов (приготовление солода C12C 1/00)

Штамм гриба Geotrichum candidum 3с-106 ((коллекция Центрального музея промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЦМПМ 1 -220/ - продуцент целлюлазы.

ИЕ (И) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3551484/28-13 (22) 11.02.83 (46) 23. 11.84. Бюл. 43. (72) А.М.Безбородов, 10.Э.Бартошевич, Н.А.Загустина, Э.С.Лебедь, В.Н.Шишкина, Н.А.Тиунова и Н.А.Родионова (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха и Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (53) 577.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

У 368303, кл. С 12 N 15/00, 1972.

2. Авторское свидетельство СССР по. заявке У 3362407/28-13, кл. С 12 N 9/42, 1982.

ЗСФ С 12 N 9/42; С 12 М 15/00;

С 12 R 1/645 (54) ШТАММ ГРИБА GKOTRICHUM CANDIDUM

Зс вЂ” 106 вЂ” ЦР0цуЦр Т щ.;ЛЛШЛАЭц. (57) Штамм гриба Geotriehum candidum

Зс-106 1(коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов

Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер

ЦМПМ -220) вЂ” продуцент целлюлазы.

1125247 2

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментных препаратов, может быть использовано для получения глюко зы для кормовых и пищевых целей из целлюлозосодержащих отходов.

Известен штамм Geotrichum candidum

Зс, характеризующийся тем, что он выделяет в среду активный комплекс ферментов, состоящий из С1 ферментов 10 .(1,4-8 -В -глюканцеллобиогидролазы

EC 3.2.-t.4), эндо-1,4-P вЂ” 9 -глюканаз(1,4- 8 -о-глюкан-4-глюканогидроазы EC 3.2.!.б) и P: -тпыхозппаз ес 3.2.l.211, способных расщеплять нативную высокоупорядоченную форму, цеЛлюлозы до растворимь1х сахаров с преобладанием глюкозы (707 от коли .чества всех образующихся восстанавливаемых сахаров) gl).

Однако указанный штамм обладает недостаточно высокой способностью к образованию ферментов целлюлолитического комплекса.

- Известен также продуцент целлюлазы 7richoderma reesei 139, синтезирующий комплекс целлюлолитических ферментов при глубинной ферментации!

С1 фермент(целлобиггидролаза) и эндо-1 4" Й -Вглюканаз. При этом

30 активность С фермента по хлопку

7"8 мг/мл(0,8-0,9 МЕ f:мл1, по бумаге

14-16 мг(мл11,3-1,40 МЕ(мл), активность эндоглюканазы по,На-карбоксиметилцеллюлозе 200-250 мг(мл) -37,046,3 МЕ(мл). Оба фермента синтезиру- З5 ются на 6-7 сут. роста культуры.(2).

Однако известный продуцент целлюлаэы не может использоваться для гидролиза целлюлозы с образованием глюкозы без дополнительного внесения 40 препаратов целлобиазы. Известно, что в результате совместного действия эндо-l,4- $ -глюканаз и целлобиогидролаз образуется преимущественно целлобиоза. В отсутствии целлобиаз или 4S при наличии их в небольшом количест-. ве происходит неполное расщепление целлюлозы. Таким образом, известный продуцент, не образующий целлобиазы, имеет ограниченную возможность прак- g0 тического использования.

Целью изобретения является получение нового штамма вЂ” продуцента целлюлазы мутанта Geotrichum сапйЫпш

Зс с повьппенной способностью к обра" зованию ферментов целлюлолитнческого комплекса при глубинном способе культивирования.

Цель достигается многоступенчатой селекцией штамма Geotrichum candidum

Зс по признаку образования целлюлазы.

В качестве мутагена используется

-нитрозометилбиурет в концентрации 0р2Х при времени экспозиции 2 и З.ч.

Выделенный активный мутант Geotrichumcandidum 3c-106 хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов института

"ВНИИгенетика", коллекционный номер

ЦМПМ 9 -220.

Полученный штамм подвергали проверке на активность целлюлазы при хранении и пересевах на свежую питательную среду.

Морфологические признаки. Мутант

Geotrichum candidumgc-106 имеет на всех средах стелющиеся, слабо септированные гифы, спороносные гифы короткие, прямостоящие или приподнимающиеся, септированные. Конидии образуются по типу артроспор, коротко цилиндрические с обрубленными концамй(5-10 4 мк), бесцветные в цепочках.

В агаровых мазках на 5 и 7 сут роста субстратный мицелий состоит из широких .гиф со слабобазофильной цитоплазмой и большим количеством метахроматика в клетке. Гифы воздушного мицелия тоньше, базофилия цитоплазмы сильнее, клетки гнф также содержит метахроматин. На 10 сут роста часть гиф;субстратного мицелия распадается на короткие обрывки (фрагменты)размером 8-10 ° 3,3 ш .

Концевые участки гиф воздушного мицелия распадаются на споры и проспоры вЂ” конидии, размеры которых . достаточно сильно колеблются:

6,6 3,2р и 5,9 3,2ш, 6,8 2,9р реже 3,6 . 3,2p . Конидии слабо искрив. лены. Особенностью штамма Зс-106

В является образование на 10 сут роста большого количества встречных гиф вЂ . мостиков, образующих "анастомо эы".

Культуральные признаки. Мупантный штамм Çc-106 на среде с русло-агаром образует: колонии(45-50 мм) со слабо выраженной зональностью, белые, паутинистые. Обратная сторона колонии кремовая, Пигмента нет. Эксудата нет.

На среде Чапека колонии мутанта

Зс-106 небольшие (12-.15 мм), кремовые, малоспорулирующие, радиальноскладчатые с паутинистым краем.

11252

Обратная сторона светло-кремовая.

Пигмента нет.

На среде Чапека-Докса колонии Ф гладкие, кремовые, паутинистые, аспорогенные, в центре белые опушенные, размером 24-26 мм. Обратная сторона колонии кремовая с оранжевым центром. Пигмента нет.

На среде Райстрика колонии мелкие, кремовые, малоспорулирующие, с силь- 10 ной радиальной складчатостью. Обратная сторона кремовая. Пигмента нет.

На агаризованной среде с бумагой

1фильтровальная бумага 1%, пшеничные обруби 2Х; (МН1) 80»1»0,15%; NaNOg. Ор15%р КН РО»»1» 0,1%>MgS04 0,05% ) .колонии Geotrichum candidum Зс-106 имеют размер 23-25 мм, белые, войлоч. ные, с более опушенным центром. Край колонии бесцветный, паутинистый.

Обратная сторона желтовато-кремовая.

Пигмента нет. На агаризованной среде с кристаллической целлюлозой 1,целлюлоза !Х:, экстракт отрубей 30%; (NHg)PO4 0,15%;

NaNO> 0-15%; КН РОу 0,1%; MgSOq 0,05%) колоиии крулиые (40-45»ее», оеелеетные, паутинистые, с широким зональным краем. Центр колонии войлочный, обратная сторона бесцветная, в

3D центре коричневая. Пигмента нет.

Биохимические признаки. Штамм

Geotrichum candidum Зс-106 активно ассимилирует галактозу, ксилозу, арабинозу, сахарозу, рамнозу, маннит, несколько медленнее глюкозу, мальто- И

sy, лактозу, сорбит, инозит, слабо ассимилирует рафинозу. Мутант 3с-106 не разжижает желатин, не пентонизирует молоко, крахмал гидролизует.

Использует нитратную и аммоиийную - 4О формы азота.

Пример. Штамм Geotrichum candidum Зс-106 выращивали глубинным способом при 28 С на среде состава,Х: пшеничные отруби 2 свекловичный 45 жом 2; (NHg)POq0,15; ¹NOg0,15;

КН Р01 0,1; MgSOq» 2Н О 0,05

Посевным материалом может служить водная суспензия конидий или мицели»альная культура двухсуточного воз-, 59 раста. . Посевной материал вносят в количестве 5% по объему. Наибольший

Уровень активности наблюдался на

72-96 ч роста культуры, Активность эндо-1,4-j5-глюканазы в фильтрате 55 культуральной жидкости Geotrichum

47 4

candidum 3c-106 определяли по падению вязкости растворов Not -карбокси» метилцеллюлозы в минуту. Активность целлобиогидролазы определяли по модифицированному методу Мандельо и Вебера.

В настоящее время для определения активности целлобиогидролазы используют метод Мандельо И Вебера с опре; деленными изменениями. По Мандельо и Веберу активность определяют при .50 С, в модификации Фениксовой и др. вЂ” при 40 С. Известно, что о при повышении температуры скорость реакции возрастает и, следовательно, значения активности будут вышее. За единицу активности целлобиазы принимали количество фермента, расщепляющее 1 мкМ целлобиазы за 1 мин при

40 С.

В таблице 1 приведены сравнитель" ные характеристики двух культурпродуцентов.

Как видно из таблицы, оба продуцента синтезируют С1-фермент примерно на одном уровне активности, а фермент эндоглюканазу известный . продуцент образует в большем количестве, но не синтезирует фермент целлобиазу. При этом синтез ферментов происходит в различные сроки.

Таким образом, преимуществом предлагаемого продуцента является его способность образовывать целлю-; лолитическую систему из трех ферментов с активной целлобиазой на 3-4 сут роста культуры в отличие от известной культуры, синтезирующей только два фермента в более поздание сроки, на шестые сутки роста. Культуру

Geotrichum сапйхс1иш можно применять. для гидролиза .целлюлозосодержащих отходов с целью получения гидролизатов глюкозы.

Предлагаемый продуцент существенно отличается от цветного спектррм синтезируемых ферментов и скоростью ,их cHHTesa °

При использовании ферментной системы с целлобиазой Сео г сЬыш

candidum Зс- 106 гидролиз целлюлозосодержащих отходов идет с образованием глюкозы. Полученнь1е гидролизатЫ» содержащие глюкозу, могут использоваться для выращивания кормовых дрожжей, получения этанола и глюкозы.

1125247

Продуцент

Максимальное

Синтезируемый фермент накопление фермента, сут

Целлобиогидролаза по бумаге

6-7

14-16

Trichoderma

reesei 139

6-8 по хлопку

200-250,Целлобиогидролаза

3-4