Способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ , предусма;тривакяций экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакриламидном геле, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода . целевого продукта и упрощения способа , перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18%-ного сернокислого кадмия iпри 62-65 С в течение 1-5 мин. (О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„il 138410

4(я) С 12 N 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABT0PCH0MV СВИДЕТИЗЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ilO ДЕЛАМ ИЗОВРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3491319/28-13 (22) 10. 09. 82 (46) 07.02.85. Бюл. У 5 (72) М.А.Володин (71) Астраханский государственный медицинский институт им.А.В.Луначарского (53) 577.15(088.8) (56) 1. Kehman F.G., Lehman D. Reganisoenzym: Isolierung der alkalishen

Prosphatase des menshlicher Placenta

und Entwicklung einer emphfindlichen Nethode fur die Fumordiagnostick.-Mern. Deutsch. Ger. Almm.tИей. 80 Konpr. Miesbaden, 1974, р. 1658-1661 .

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 1082811, кл. С 12 N 9/14, 1984.

1 (54)(57) СПОСОБ ВЫ ЕЛЕНИЯ ТЕРМ0СТАБИЛЬНОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОС ФАТАЗЫ, предусматривающий экстрагнрование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электройорез в полиакриламид ном геле, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода . целевого продукта и упрощения способа, перед диализом проводят пов- торное прогревание в присутствии

0,14-0,18Х-ного сернокислого кадмия при 62-65аС в течение 1-5 мин.

1 11384

Изобретение относится к медицине, а именно в биохимии, и может быть использовано для выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы. 5

Известен способ выделения щелочной фосфатазы, включающий обработку гомогената ткани бутанолом, фракционирование ацетоном и сульфатом аммония, гельфильтрацию и ионообменную хро- 10 матографию 1).

Недостатками данного способа являются его сложность, длительность и низкий выход целевого продукта.

Наиболее близким к изобретению 15 по технической сущности и достигаемому эффекту является способ выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающий экстрагирование ткани 3 M раст-, вором хлористого натрия, прогревание экстракта в течение 10 мин при 65 С, фракционирование хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония, диализ.. и очистку целевого продукта электро- 25 форезом в полиакриламидном геле 2 ).

Недостатками известного способа являются невысокий выход целевого продукта (72 ), а также его сложность,, заключающаяся в наличии двух стадий фракционирования.

Цель изобретения — увеличение выхо-. да целевого продукта и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы, предусматривающему экстрагирование ткани раствором хлористого натрия, прогревание экстракта, диализ и электрофорез в полиакри«40 ламидном геле, перед диализом проводят повторное прогревание в присутствии 0,14-0,18 -ного сернокислого кадмия при 62-65 С в течение 1-5 мин.

Эффективность очистки при варьировании в предлагаемых интервалах концентраций сернокислого кадмия, температуры и времени практически не изменяется. За пределами этих интер-.50 валов или не достигается очистки фермента, например, прогревание при 45 С, или происходит его инактивация (табл. 1).

Прогревание без добавления серно- 55 кислого каДмия .приводит к 4,3-крат-, ному увеличению удельной активности целевого продукта.

f0 2

Добавление сернокислого кадмия в концентрации 0,14-0,18Х не приводит к значительному увеличению удельной активности: в этом случае выпадает в осадок около ЗОХ балластных белков и удельная активность фермента возрастает в 13,5 раз °

Однако одновременное проведение двух обработок сернокислым кадмием и нагреванием, приводит к 15-кратной очистке с очень высоким выходом— более 90 .

Пример 1. 1 этап. Приготовление плацентарного тканевого экстракта: гомогенизация при 8000 об. /мин в течение 5 мин отмытой от крови плаценты в 3 M растворе хлористого калия (вес-объемное соотношение

1:3-4); перемешивание на магнитной мешалке при 4 С в течение 12 ч; центрифугирование при 6000 об./мин в течение 30 мин. Дальнейшее исследование проводят .с надосадочной жид-. костью после диализа против дистиллированной воды (2 смены по 60 .мин) и 0,1 моль раствора хлористого натрия (2 смены по 60 мин).

2 этап. Полученный плацентарный экстракт прогревают при 65ОС в течение 10 мин и центрифугируют при

8000 об,/мин в течение 20-30 мин.

3 этап. К надосадочной жидкости добавляют сульфат кадмия из расчета

0,14 -ной концентрации в итоговом растворе и проводится повторное прогревание при 65 С в течение 3 мин.

Осадок отделяют путем центрифугирования при 8000 об./мин в течение 2030 мин.

4 этап. Надосадочную жидкость диализуют в течение 10-12 ч против ацетатного буфера (рН 4,5).

5 этап. Доочищение препарата проводится методом препаративного диск-электрофореза в 7 -ном полиакриламидном геле с последующим извлечением из геля термостабильной щелочной фосфатазы электрофоретически.

Гель, содержащий фермент, вырезают под визуальным контролем после окрашивания методом азосочетания (субстрат — нафтол — AS — BS — фосфат, краситель — прочный синий соль В).

Количество очищенной термостабильной щелочной фосфатазы определяют методом Лоури. Результаты очистки термостабильной щелочной фосфатазы плаценты даны в табл. 2.

Таблица 1 с

Условия выделения

Общая Вес Удельная Выход, Х актив- белка, нг активность, ость, ед ед./мг

Количество исследуемого материала, мл

Прогревание при

45 С

1200 15870 6850

2,3

100,0

Прогревание при

65 С

93,8

1150 14900 1520

9,8

Добавление сульфата кадмия при прогревании

45 C : 0,14Х

О, 18Х

65 С: 0,14Х

2,4

1150 15700 6500

1150 15650 6400

1070 14790 470

1050 14740 430

98,9

98,8

2,44

31,5

93,1

0,18

34,3

93,0

80 С : 0,14

985

0,18

980

65 С 0,26Х

0,6

350

220

1,4

1050

3 11384

П,р и м е р 2. Выделение проводят аналогично примеру 1, но используют

0,18Х-ный раствор сульфата кадмия.

Выход на этой стадии составляет 93Х против 93,1% по примеру 1.

Зависимость активности щелочной фосфатаэы от условий выделения (температуры и концентрации сульфата кадмия) дана в табл.

Прогревание при 62 в течение 1р

1 или 5 мин приводят к тем ае результатам (табл. 1).

При введении вместо сульфата кадмия 0,28Х-ного сульфата натрия

10 4 при последующем прогревании не наб людается увеличение выпадания в осадок балластных белков по сравнению с контрольным опытом, в котором не добавляют никаких солей.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно увеличить выход целевого продукта с 72Х до 92,9Х, а также значительно упростить выделение фермента за счет замены стадий фракционирования хлористым цетилпиридинием и сульфатом аммония простейшей стадией термообработки.

1138410

Таблица 2

Количест во белка

Условия очистки

Эт ап мг

100,0

1200

15880

6900 2,3

1520 9ю8

93,8

14900

2 Первичное прогревание 1150

3 Добавление сульфата кадмия

93,2

14800

1100

1120 13,2

4 Вторичное прогревание

93,1

1070

470 31,5

350 42,2

14790

14770

92,9

1070

5 Диализ при рН 4,5

6 Итог (после электрофореза) 41,2 358,4

14770

10,0

92,9

Составитель В. Муронец

Редактор И.. Дербак Техред;Т,дубинчак КоРРектоР Л. Пилипенко

Заказ 760 Тираж 525 Подписное

RHHHIlH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1, Экстракт после обработки хлористым калием

Количество исследуемого материала

Общая активность ед. дельная активность ед./мг

Выход целевого про-, дукта,X .Ю - - 4- - 4.