Способ определения фибронектина

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЖНИЯ ФИБРОНЕКТИНА путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина, отличающий тем, что, с целью повышения точности способа при определении биологически активного фибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором желатина при рН 8,010 ,0, взятого в концентрации 10 12 мкг/нл. W

СОКИ СООЕТСНИХ

СВИМНЮ

РЕСПУБЛИК

4 (51 G 01 N 33 50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И QfHPbff ÈÉ

ОПИСЯНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н *ВТОРСКОВВ СВИДВТВУВФТВ\Г!

Р !

) (21) 3529749/28-13 (22) 29.12.82 (46) 07.02,85. Бюл. И- 5 (72) Г.А.Ермолин, В.Э.Котелянский;

Е.Е.Ефремов, М.А.Глухова, Л.В.Курма-. нова, М.А.Черноусов и M.Ë.Ìåòñèñ (71) Всесоюзный кардиологический ,научный центр AMH СССР (53) 612.!15(088.8) (56) 1.Lau rell С.В. Ejecta-immuпоаваау. Scaud J. Иеп-LàÚ. п VEST, 1972, 29 suppl. 124.21"27.

2,Авторское свидетельство СССР .по заявке У 3516449, кл. G 01 N 33/48, 22.09.83.

„S0„„11 742 А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРОНЕК

ТИНА путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с поспедующим определением связавшегося с .сорбентом фибронектина, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа при определении биологически активного фибронектина, в качестве иммуносорбента используют полистирол, обрабо-. танный раствором желатина при рН 8,010,0, взятого в концентрации 1012 мкг/мл.

1 11

Изобретение относится к иммунохимии и может быть использовано в клинике для определения дефицита фибронектина в биологических жидкостях организма, выявления гиперфибронектинемии, а также для количественного определения фибронектина в процессе его промьппленного производства.

Известен способ определения фибронектина с помощью "ракетного" иммунофореза, предусматривающий нанесение контрольного и исследуемого образца в лунки пластин иэ геля агарозы, содержащей антитела к фиб ронектину, и осуществление электрофореза в течение !2-16 ч при 4 С.

После этого гели отмывают 3-4 дня, высушивают, окрашивают, измеряют вы-, соту образовавшихся "ракет" и по высоте определяют содержание фибронектина 111.

Недостатками указанного способа являются длительность определения и низкая производительность (не более 20-25 анализов в день). Кроме того, этим способом определяют только суммарный фибронектин без учета его биологической активности, характеризующей состояние факторов неспецифической защиты организма.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения фибронектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, представляющим собой бактериальные клетки, обработанные глутаровым альдегидом и 0,1-0,5Х-ным раствором желатина, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина по агглютинации, осуществляемым визуально или путем микроскопирования (2), Чувствительность определения

0,125 мкг фибронектина, при этом определяется фибронектин, сохранивший биологическую активность, т.е. способность связываться с желатином.

Недостатком способа является невысокая точность определения, обусловленная тем, что при постановке . агглютинационной пробы готовят ряд разведений исследуемой сыворотки (1:l-l:356) и оценку результатов осуществляют путем визуального наблюдения или с помощью микроскопи38742 2

5

35 рования, что не исключает субъективной оценки.

Точность и воспроизводимость определения фибронектина зависит также от свойств и спецификации применяемого иммуносорбента, полученного на основе бактериальных клеток.

Целью изобретения является повышение точности способа при определении биологически активного фибро. нектина, Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения фибронектина путем инкубации исследуемой пробы с иммуносорбентом, содержащим в качестве лиганда желатин, с последующим определением связавшегося с сорбентом фибронектина, причем в качестве иммуносорбента используют полистирол, обработанный раствором при 8,0-10,0, взятого в концентрации 10-12 мкг/мл, Это позволяет не только количественно определить фибронектин, обладающий биологической активностью, но и значительно повысить точность определения за счет использования сорбента, обладающего заранее заданными, стандартными свойствами, что создает реальные предпосылки для автоматизации определения °

Определение связавшегося с сорбентом фибронектина можно осуществлять иммуноферментным методом.

Способ обычно осуществляют следующим образом.

Полистирол при рН 8,0-10,0 обрабатывают раствором желатина при концентрации 10-12 мкг/мл в течение

15-24 ч при 4 С. Полученный иммуносорбент многократно отмывают водой с 0,05% Твин 20, затем наносят образцы плазмы крови и инкубируют их 30 мин при 37 С. После отмывки несвязавшихся белков на образовавшийся комплекс полистирол-желатин-фибронектин наносят антитела к фибронектину, ковалентно связанные с ферментом, инкубируют 30 мин при 37 С, отмывают, добавляют соответствующую субстратную смесь и по интенсивности окраски определяют содержание фибронектина в исследуемой пробе.

Предлагаемым способом можно определить биологически активный фибронектин в количестве от 5 до 800 нг/мл, Время проведения анализа не превышает

1138742

Составитель А,дижур

Редактор С.Патрушева Техред Л.Коцюбняк КорректорЕ.Сирохман

Заказ 10681/35 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква,. R-35, .Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1,5-2 ч, если учесть, что полистироловые плашки или пробирки можно заранее обрабатывать желатином и хранить до использования.

Пример . В лунки нового титровального планшетадля серологических реакций заливают по 200 мкл раствора желатина в карбонатном буфере рН 9,6 (содержание белка 10 мкг/мл). Планшет инкубируют в течение 24 ч при 10

4 С, затем многократно отмывают водопроводной водой с 0,057 Твин 20 и вносят в лунки по 200 мкл исследуемых образцов плазмы крови, разведенных 1:1000 фосфатно-солевым буфером f5 рН 7,2. Образец инкубируют в лунках в течение 30 мин при 37 С. Лунки снова отмывают и в каждую добавляют по 200 мкл конъюгата противофибронектиновых антител с пероксидазой, 20 разведенного 1:2500. Конъюгат инкубируют 30 мин при 37 С, затем отмыва" ют лунки и каждую лунку заполняют

200 мкл субстратной смеси, состоящей из 0,00!5 -ного раствора Н О с 0,01Х ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере, рН 4,7. После инкуо бации в течение 10 мин при 37 С реакцию останавливают добавлением в лунки 50 мкл 507-ной серной кислоты. Интенсивность развившейся окраски субстратной смеси измеряют фотометрически при Й = 492 нм.

Предлагаемый способ прост и доступен для освоения. Используя заранее заготовленные микротитровальные планшеты, обработанные желатином, можно провести определение за 1,52 ч, что позволяет отнести предлагаемый способ к методам экспрессанализа.

Следует отметить также воэможность унификации предлагаемого способа, его высокую чувствительность и точность.