Способ получения индоксильных или тиоиндоксильных сложных эфиров аминокислот или пептидов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДОКСИЛЬ НЫХ ИЛИ ТИОИНДОКСИЛЬНЫХ СЛОЖНЫХ ЭФИ РОВ АМИНОКИСЛОТ или ПЕПТИДОВ общей формулы I 0-А-В где . - одинаковые или различны и означают водород, гал ид, низпгую . алкильную, а коксильную, арильную, ар кильную, аралкоксильнуго, гидроксильную, карбоксил ную, карбокси (низший) ал ксильную, аралкоксикарбонильную , аралкоксикарбоНШ1 (низший) алкоксипьную , нитроили низшую ациламиногруппу, или два соседних заместителя означают бензоаннелированный остаток; X - сера или незамещенная иминогруппа или замещенная алкильным, аралкильньм , арильным или ацильным остатком, иминогруппа; А - моноаминокарбоновая кислота или аланинсодержащий диили три-пептидный остаток; В - N-защитная группа в пептидной части (остатке), чающийся тем, что ие общей формулы И имеют указанные значения, ют взаимодействию с галоидани или смешанными ангидридами, вированными сложными эфирами бщей формулы III Н - О - А - В В имеют указанные значения.

СОЮЗ СОВЕтСНИХ

СОЦИАЛИСтИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

q(51) С 07 D 209 12

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ ди- или три-пептидный остаток;

Н-защитная группа в пептидной части (остатке), ю шийся тем, что бщей формулы II

В отлича соединение о

Н-О-А-В

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ. СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3346097/23-04 (62) 2853140/23-04 (22) 16.10.81 (23) 19. t2.79 (31) Р 2854987.3 (32) 20.12.78 (33) ФРГ (46) 15. 05. 85. Бкп. W 18 (72) Дитер Бергер, Франц Браун, Вернер Гютляйн, Манфред Кур и Вольфганг Вернер (ФРГ) (71) Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (53) 547.755.0?(088.8) (56) 1. Бюлер Н., Пирсон Д. Органические синтезы. М., "Мир", l973, ч. 2, .гл. 14. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДОКСИЛЬНЫХ ИЛИ ТИОИНДОКСИЛЬНЫХ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ АМИНОКИСЛОТ ИЛИ ПЕПТИДОВ общей формулы I где R -R+ — одинаковые или различные и означают водород, галоид, низшую . алкильную, алкоксильную, арильную, аралкнльную, аралкоксильную, . гицроксильную, карбоксиль-. ную, карбокси (низший) алко„„SU „„1156595 А ксильную. аралкоксикарбонильную аралкокснкарбонил (низший) алкоксильную, нитро- или низшую ациламиногруппу, или два соседних заместителя означают бензоаннелированный остаток; — сера или незамещенная иминогруппа или замещенная алкильным, аралкильным, арильным или ацильHbtM ocTBtKoM иминогруппа; — моноаминокарбоновая кислота или аланинсодержащий Я

М где К -В е и Х имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с галоидангидридами или смешанными ангидридами, или активированными сложными эфирами кислот общей формулы III где А и В имеют указанные значения.

1156595

Изобретение относится к области ! получения новых сложных эфиров аминонокислот или пептидов, которые могут быть использованы в качестве диагностических средств. 5

Известно получение сложных эфиров взаимодействием спиртов с галоидангидридами кислот, смешанными ангидридами или активированнь:ми сложными эфирами кислот )t). 1О

Цель изобретения — разработка на основе известного метода способа получения новых соединений для быстрой и простой диагностики, Поставленная цель достигается способом получения индоксильных или

° тиоиндоксильных сложных эфиров аминокислот или пептидов общей формулы

R1

О-A-8

Ц, где R --Н вЂ” одинаковые или различные 2

1 4и означают водород, галоид, низшую алкильную, алкоксильную, арильную, аралкильную, аралкоксильную, гидроксильную, кар- 30 боксильную, карбокси (низший) алкоксильную, аралкоксикарбонильную, аралкоксикарбонил (низший) алкоксильную, нит- 35 ро- или низшую ациламиногруппу, или два соседних заместителя означают бензоаннелированный остаток; 40

Х вЂ” сера, или незамещенная аминогруппа, или замещенная алкильным, аралкильным, арильным или ацильным остатком аминогруппа;15

А — моноаминокарбоновая кислота или аланинсодержащнй дк- или трипептидный остаток;

 — И-защитная группа в пе- ур тидной части (остатке), согласно которому соединение общей формулы 81

2 QH где R.-R и Х имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с галоидангидридами или смешанными ангидридами, или яктинированными сложными эфирами кислот общей формулы

H0 — А — В где Л и Р. имеют указанные значения.

В качестве обычной в химии пептидов защитной для азота группы в определении В нужно понимать, например ацильную, оксикарбонильную, тиокарбонильную, сульфонильную, сульфенильную, линильную, циклогексенильную, фосфорильную или карбомоильную группы.

Пример 1. 3-/N-/Толуол-4 сульфонил/-1: аланилокси/-индол.

Раствор 1. Для приготовления хлор° ангидрида кислоты по одностадийному способу 5 35 r (0,22 моль) N-/толуол-4-сульфонил/-1.-аланина растворя.ют в 20 мл абсолютного диметилформамида (ДМФ) и охлаждают до -30 С, 3атем при перемешивании и охлаждении добавляют пипеткой 1,76 мл (0,024 моль) хлористого тионила и реакционную смесь оставляют на 30 мин в охлаждающей бане при -30 С.

Раствор 2, В трехгорлую колбу емкостью 250 мл, снабженную мешалкой, термометром и трубкой для подачи и отвода газа, вносят после полногo удаления воздуха за счет слабого тока азота раствор 2,90 г (0,022 моль) индоксила (3-окси-индола) в 40 мл абсолютного ДИФ, добавляют 9,74 мл абсолютного пиридина и охлаждают до -15 С.

Взаимодействие. Приливают раствор 1 к раствору 2 и перемешивают в отсутствие кислорода и влаги примерно в течение 5 ч при -15 С до тех пор, пока с помощью тонкослойной хроматографии нельзя более обнаружить индоксил.

Для обработки реакционную смесь концентрируют в вакууме максимально при температуре бани 40-50 С. Остаток растворяют в 100 мл уксусного эфира и промывают последовательно дважды по 30 мл 1н. раствора лимонной кислоты, 20 мл воды, 50 мл

5%-ного раствора бикарбоната натрия и. 25 мп воды. Уксусноэфирную фазу после высушивания над сульфатом натрия выпаривают в вакууме.

3 !156595 4

Полученный сырой продукт очищают кристаллы т,пл. 138 С- rlг -28 0 у ° ° в в ° 1 t с помощью колоночной хроматографии с = tX (метансл); на силикагеле смесью толуола с диок- 1.9 3-/N /áåíçèëoêñèêàðáoíèë/-Ь— саном (9:1). После отгонки раствори- аланилокси/-6-хпор-чндол бесцветтечя из собранных фракций в вакууме 5 ные кристаллы т.пл 170 С ф ° ° ° Л благодаря замешиванию остатка в эфи- -41,3, с = 1Ж (метанол); ре получают 1,45 г (18,4Z) 3-N-/то- 1. 10 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-L-! луол-4 -сульфонил/-L-алакилокси/-ин-, аланилокси/-4-хлор-5 бром-индол, дола, бесцветные кристаллы, т.пл. бесцветные кристаллы, т.пл. 150, го . 56 6, с = tg (метанол) 10 152 С; .р .. -3tý0, с = 1Ж (метанол);

В качестве побочного продукта из 11 3-/>-/толуол-4 -сульфонил/-Lдругих фракций указанного отделения аланилокси/-4,5,7-трихлориндол с помощью колоночнпй хроматографии 1. 12 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Ь— выделяют еще 0,89 г (11,3X) 1-/N-/- аланилокси/-4-хлор-5-бром-7-метилf толуол-4 -сульфонил/-L-аланилокси/-3- 15 индол; слабо окрашенные в бекевый оксииндола-1-/N/òoëóoë-4 -сульфо- цвет кристаллы, т пл 143-145 С нил/-L-аланилокси/-3-сксоиндолина ТХ: готовая пластина (Fertigplatиз уксусного эфира: бесцветные кри- ил геля, элюирующее средство сталлы, т.пл. 187-188 С; d г„ :41,7о толуол:диоксан 2:1, индикация: УФ, 20 NH,(ãàç), Rf-значение 0,56.

1 вза„ одей твин ° 3- - Толуол-4 -сульфонил/-Ьзамещенных индоксильных соединений аланилокси/5-окси-индол; с соответствующими аминокислотами

1,14 3-/N-бензилоксикарбонил/-Ь-елаполучают следующие субстраты причем

Э I (кроме 7 23 — 7 27) 25 1 . 15 3 — / — / олУол — — сУльфоч /-.— в качестве побочных продуктов обра- аланилокси/-5-бенэилокси-индол

Э чуются указанные 1-замещенные индолы аланилокси/-4-карбокси-индол;

3-/N-/бенэолоксикарбонил/-L-ала0 аланилокси/-4-бензилокси-карбонил лы, г.пл. 123 С; k"- 49,0,с = tX индол; (метанол); 1. 18 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Ь1 ° 2 3-/N-/бензилоксикарбонил/-L- аланилокси/-5-/карбоксиметокси-инапанилокси/-4-метил-индоп, бесцвет° 19 3-/N-/voJIyo 4

44,6, с = 1Е (метанол) аланилокси/-5-/бенэилскси-карбонил1.3 3-/N-/бензилоксикарбонил/-Lметокси/-индол; аланилокси/-5-метил-индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 143-144 С; . 1.20 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Ь— 2о о .л . «48 2 с = t 7 (метанол); 40 аланилокси/-6-нитРо-индол

У

1.4 3-/N-,/áåíçèëoêñèêàðáoíèë/-Ь- 1. 21 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Lаланилокси/-б-метил-индол, бесцвет- аланилокси/-6-ацетиламино-индол; ные кристаллы, т.пл. 148 С; о(1. 22 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-L-49,0, с = 17. (метанол); аланилокси/-бензо/g/-индол;

1 ° 5 3-/N-/бензилоксикарбонил/-Ь- 45 1 23 1-метил-3-/N-/бензилоксикарбоаланилокси/- HHJI/-Ь-аланилокси/-индол бе ол, есцветные ные кристаллы, т,пл. 146 С; а : кристачлы, т.пл. 92 С,(": -49 5 о ф ° ° ° г ° у

-51,2, с = t X (меч анол); с " 17 (метанол);

1.6 3-/N-/бензилоксикарбонил/-L- с(. 1.24 1-бензил-3-/N-/толуол-4 -сульаланилокси/-4,7-диметилиндол,бесцвет-50 Фонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 121 С; ные кристаллы т. пл. 149-152 С ° о

° ° ° р 20

9 а Ф

-46,3, с = 17 (метанол); 0 р: -54,9, c = 17 (ДИФ) °

У

1. 7 3-/N-/бензилоксикарбонил/-Ь hatt 1 25 1 Фенил-3-/N-/толуол-4 -сульфоаланилокси/-4-хлор-индол, бесцвет- нил/-L-аланилокси/-индол; ные кристаллы, т.пл. 142-143 С; 55 1 ° 26 1-ацeтил-3-/N-/толуол-4 -сульфоо р . -61,4, с = 17 (метанол); нил/-L-аланилокси/-индол;

1.8 3-/N-/бензилоксикарбонил/-Lаланилокси/-5-бром-индол, бесцветные фонил/-L-аланилокси/-индол, бесцвет1156595 е кристаллы, тфпл ° 155-156 С; Ы ;:

-54,7, с 1Х (ЛИФ);

1.28 3-/И-/бенз Ьлоксикарбонил/-глицилокси/-индол бесцветные кристаллы, т.пл. 122-124 С;

1.29 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-глицилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 103-105 С;

1.30 3-/И-/толуол-2 -сульфонил/-Lаланилокси/-индол бесцветный аморф10 ный порошок; о : -62,5, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксан

9: 1, индикация: УФ, ИН,(газ) Rf значение 0,20.

1.31 3-/И-/Толуол-3 -сульфонил/-Lйланилокси/-индол, бесцветные кристаллы; т.пл, 94 С; 4 : -54,9, с 1Ж (метанол);

1.32 3-/И-/толуол-4 -сульфонил/-Dаланилокси/-индол, бесцветные кристаллы ° т,пл ° 98 Су с в +53у1 9 с = 1X (метанол);

1.33 3-/N-/бензилоксикарбонил/-О, Еаланилокси/-индол, бесцветные кристалnb> т.нл. 110-111 С;

1.34 3-/N-/бензилоксикарбонил/-L— валилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 73-75 С;, " -42 2 30 с = 17. (метанол);

1.35 3-/N-/бензилоксикарбонил/-Lлейцилокси/индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 64-65 С; о/ ;; -41,1, c = 1X (метанол); д

1.36 3-/N-/бенэилоксикарбонил/-L изолейцилокси/-индол бесцветный аморфный порошок; с4 . -30,6, с = 1X

28. (метанол) °

4О

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксан

2: 1, индикация: УФ, ИН (газ), Rf— значение 0,57 °

1.37 3-/И-/Венэилоксикарбонил/-ьфенилаланилокси/-индол желтоватые кристаллы, т.пл. 125 С; ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксан 9:1, индикация: УФ, NH (газ), Rf-значение 0,56; Я

1,38 3-/И-/толуол-4 -сульфонил/-Lфенилаланилокси/-индол, бесцветные . кристаллы, т.пл. 16?-169 С; (:

-34,4 С, с = 1X (метанол);

1.39 3-/N-ацетил-Ь-тирозилокси/-ин- 55 долу

Ф

1.40 3-/И-бензоил-1.-тираэилокси/«индол °

1.41 3-/N-/бензилокснкарбонил/-1тирозилокси/-индол, бесцветная аморфная печа; l .;: -22,6, с = 1X (метанол) .

ТХ; готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксан

4: 1, индикация: УФ, NH, (газ), Rf— значение 0,27;

1.42 3-/N-/Толуол-4 -сульфонил/-.Lтирозилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 171 С; о ;: -28,3, с = 17 (метанол);

1.43 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-0ацетил-L-тирозилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 168-170 C; pl

-24,1, с = 1Ж (ДМФ);

1.44 3-/N-/бензипоксикарбонил/-Lаланил-1.-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 144 С; сГ

-17,3, с = 1X (метанол);

1.45 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Dаланил-Ь-аланилокси/-индол, желтоватая аморфная пена; о . +5,8, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая. пластина силикагеля элюирующее средство толуол-диоксан

4: 1, индикация: УФ, NH,(газ), Rf значение 0,19.

1.46 3-/N-/Бензилоксикарбонил/-L аланнл-L-аланил-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 156 С; о з : -39,5, с = 1Ж (метанол);

1,47 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-Dаланил-D-аланил-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 216 С;

Ы . +53,8, с = 1Ж (метанол);

1.48 3-/N-/ацетил-Е-аланилокси/-индол, бесцветная аморфная пена;

-12,5, с = 17 (метанол), ТХ: готовая пластина силикагеля (элюирунлщее средство уксусный эфирдихлорметан 10: 1, индикация: УФ, ИН (газ), Rf — значение 0 33.

1.49 3-/N-Сукцинил-L-аланилокси/индол, бесцветные кристаллы, т.ïë.

142 С; с в . -63,9, с = 1X (метанол);

1.50 3-/N-бензоил-D, L-аланилокси/индол, бесцветные кристаллы, т.пл.

171 С3

1.51 3-/N-фталоил-Е-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 58 С;

g g : -26,3, с = 1X (метанол).

1.52 3-/N-/этоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы,. т.пл. 96 С; е(, . -68,9, с = 1Ж (метанол).

1156595

1,53 3-/N-/циклогексилоксикарбонил/L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллй, т.пл. 149 С cd2 : -60,4, с = 1X (метанол);

1.54 3-/N-/феннлоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 161 C о : -96,0, с = 17 (метанол); 1,55 3-/N-/4 -метил-бензилоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол, 10 бесцветные кристаллы, т.пл. 135 С; а . -45,9, с = 17. (метанол) °

1.56 3-/N-/4 -нитро-бензилоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол, желтоватые кристаллы, т. пл. 160 С; g : -29, 4 С, с = 1X (метанол) .

1.57 3-/N-/бензилтиокарбонил/-L-аланилокси/-индол бесцветные кристаллы, т.пл. 122 С; о о: -77,8, с = 1X (метанол);

1.58 3-/N-метансульфонил/-Е-алани20 локси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 164-166 C; а 2 : -54,0, с = 17 (метанол);

1.59 3-/N-/бензилсульфонил/-L-ала.нилокси/-индол, бесцветное вязкое

25 масло; с : -54,8, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-уксусный эфир 2;1, индикация: УФ, NH,(ãàç), Rf — значение 0,40, 30

1.60 3-/N-Бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветное вязкое масло; Ы > . -59,8, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол--- уксус- 35 ный эфир 2: 1, индикация, УФ, NH (газ), Rf - значение 0,48.

1.61 3-/К-/4 -Бром-бензилсульфонил/L-аланилокси/индол, желтоватый аморфный порошок, ТХ: готовая пластина си-49 ликагеля, элюирующее средство толуолдиоксан 4:1, индикация: УФ, КН (газ)

Rf — значение 0,39.

1.62 3-/N-/4 -Нитро-бензолсульфонил/L-аланилокси/-индол, бесцветные кри- 43 сталлы, т.пл. 136-137 С; 3, :-35,9, с = iX (метанол);

1.63 3-/N-/4 -ацетиламино-бенэолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 162-163 С; g : 5O

-57,2, с = 1X (метанол);

1.64 3-/N-/4 -н-бутил-бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 105 С; а 1 . -46,1, с = 1X (метанол). 55

1.65 3-/К-/4 -трет-бутил-бензолсульфонил/-L-.âëàíèëîêñè/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 140 С; 4 :

-43,3, с 17 -(метанол);

1 ° 66 3-/N-/4 -н-октил-бензолсульфоннл/-Е-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 57 С о 1

-34,2, с = 1X (метанол);

1.67 3-/N-/4 -окси-бензолсульфонил/L-аланилокси/-индол, вязкое слабо красноватое масло; ТХ: готовая ппастина силикагеля, элюирующае средство толуол-диоксан 1;1, индикация:

УФ, КН,(газ) Rf — значение 0,62.

1.68 3-/N-/4 -MeToKcH-áåíçîëñóëüôîнил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные

128ОС Я4

-54,3, с = 1X (метанол);

1.69 3-/N-/4 -бенэилокси-бенэолсульфонил/-L-аланилокси/-индол бе цветные кристаллы, т.пл. 112 С; 4

-40,3, с = 17 (метанол);

1.70 3-/К-/4 -/2 окси-этокси/-бенэолсульфонил/-L-аланилокси/-индол

1.7f 3-/N-/4 -/3" -окси-5 -оксн-нпентилокси/-бензолсульфонил/-1-аланилокси/-индол бесцветное вязкое

0 9 масло; с . -36,4, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол - этилацетат 1:10, индикация: УФ, КН (гаэ), Rf — значение 0,37.

1.72 3-/N-/4 -/3", 6 -Диокси-н-гептилокси/-бенэолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, слабо красноватое вязкое масло; ТХ: готовая пластина силнкагеля, элюирующее средство толуолдиоксан 4:t, индикация: УФ, NH (газ)

Rf — значение 0,21, 1.73 3-/N-/4 -/2"-Окси-зтил/-бензол-. сульфонил/-L-аланилокси/-индол, жел товатьпЪ, аморфный порошок; et f = -54,5 с = 1Х (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство: толуол — этилацетат 1:2; индикация: УФ, КН (гаэ), Rf - значение 0126.

1.74 3-/И-4 -/2 -/4" -Нитро-бенэилокси/ этил/-бензолсульфонил/-L-алаиилоксииндол;

1.75 3-/К-/4 -/2"-хлор-этил/-бензол« сульфонил/-L-аланилокси/-индол, слабо красноватая аморфная пена; :

-48,3, с = 1X (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство: толуол — уксускый эфир 5е 1у индикацияе УФ КН (ras)

Rf — значение 0,20.

i.76 3-/К-/4 -Циано-бензолсульфонил/-

L-аланилокси/-индол, бесцветные кри1156595

9 сталлы, т.пл. 181 С; о ": -47,0 с 1% (Ф);

1.77 3-/N-/4 -карбокси-бензолсульфонил/-L — аланилокси/-индол, бесцвет5 ные кристаллы г, пп. 14

-51,0, с = 1% (метанол) .

1.78 3-/N-/4 -5енэилоксикарбонил-, . бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 178 С; с : -42,8, с = 1% (ацетон);

2О о 10

1.79 3-/К-/4 -карбомоил-бензолсульфонил/-1-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 206 С; g : -58", с = 1% (ацетон), 1.80 3-/М-/4 -/диметил-карбомоил/t 15 бензолсульфонил/-L-аланилокси/индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 170-172 С; о р -46,4, с = 1% (ДИФ);

1.81 3-/N-метил»Н-/толуол-4 -сульфоннл/-L-аланилокси/-индол, бесцветные

20 о 2о, о кристаллы, т.пл. 82 С; с ; -4,2 с = 1% (метанол);

1.82 3-/М-/2,4, 6 -триметил-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 19225

194 С g ß : -63,8, с = 1% (метанол);

1.83 3-/N-/бифенил-4 -сульфонил(-Ьаланилокси)-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 159 С; с : 42,0, с = 1% (метанол); 30

1.84 3-/N-/нафталин-2 -сульфонил/-Ьаланилокси/-индол, слабо красноватые кристаллы, т.пл. 103-!05 С; ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол — диоксан 4: 1, инди- gi кациЯ: УФ, NH,(газ), Rf -значение 0 41 1.85 3-/N-/4 -Ацетиламино-нафталин1 -сульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 129132 С; о : -63 ° 2, с = 1% (метанол).

1 ° 86 3"/N-/5 -диметиламино-нафталин(1 -сульфонил/-L-аланилокси-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 170 С; е . -30,7, с = 1% (метанол);

1.87 3-/N-/бенэилоксикарбонил/-I.— аланилокси/-бензо-/в/ тиофен, бесцветное, вязкое масло; .(" -42,2, с = 1% (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство дихлорметан, индикация: УФ, NaOH/К, Fe(CN) ; Rf значение 0,13.

1.88 3-/N-/Толуол-4 -сульфонил/-Lаланилокси/-5-бензил-индол;

1.89 3-/N-/толуол-4 -сульфонил/-I,—

/ аланилокси/-5-фенил-индол.

Н р и и е р 2. 3-/N-/трет.-бутилоксцкарбонил/-1.-аланилокси/-ичдол.

Для взаимодействия по карбодиимидному способу 3,23 г (0,017 моль), N-трет.-бутилоксикарбонил-I,-аланина и 2,27 г (0,017 моль) индоксила растворяют н 100 мл смеси абсолютного диоксана-лихлорметана 1:1. После добавки растнора 3,87 г (0,019 моль)

I дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в

20 мл абсолютного ди ксана перемешивают н течение 68 ч при комнатной температуре в отсутствие влаги и кислорода. Выделившуюся И,И -дициклогексилмоченину отсасывают, растн<ритель отгоняют н вакууме и остаток растворяют примерно н 100 мл этилацетата, После отсасывания следующего количеств," выделившейся N N— дициклогексилмоченины прозрачный этилацетатный раствор последовательно промывают по дна раза 30 мл 1 н. лимонной кислоты, 20 мл воды, 50 мл

5-10%-ного раствора бикарбоната натрия и 25 мл воды, После высушивания над сульфатом натрия этилацетатную фаэу концентрируют н вакууме, Аморфный остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с помощью смеси толуол-диоксан (9:1) .

После концентрирования собранных фракций в вакууме и перекристаллизации остатка из смеси уксусного эфира и эфира (1:1О) получают 1,04 r (20%) 3-/N/-трет-бутилоксикарбонил/L-аланилокси/-индола: бесцветные кристаллы, т.пл. 158 С; 4 : -65 0, с = 1% (метанол).

В качестве побочного продукта при этом взаимодействии также образуется замещенный н I-положение 3-оксииндол (см, пример 7), Аналогично получают путем взаимодействия соответственно замещенных индоксильных соедчнений с соответствующими аминокислотами следующие субстраты, причем также здесь во всех случаях в качестье побочных продуктов образуются соответствущие замен щенные в I-положение 3-оксн-индолы;

2.1 3-/N-формил-L-аланилокси/-индел, бесцветные кристаллы, т.пл, 1211?2 С; о(, : -2.5, с = 1% (метанол);

2.2 3-/N-/4 -бензилоксикарбонил/-Lаланилокси/-индол, бесцнетяые кристаллы, т.пл. 92 С; ос", . -42,9, с = 1% (метанол);

1156595

2.3 3-/N-/N-/пиперидино/-оксикарбанил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 104 С; 0>

-24,7, с = 17. (метанол);

2.4 3-/N-/тиенил-/2 -метоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветго ные кристаллы, т.пл. 134 С, о, -55,7, с = 1X (метанол);

2. 5 3-/N-/хинолин-8 -сульфонил/-1, -аланилокси/-индол аморфный, сла10 бо красноватый порошок, ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол — диоксан 4:1, индикация: УФ, NH,(ràç), Rf — значение 0,23.

2,6 3-/N-/Дифенилкарбамоил/-L-алани1S локси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 188-190 С, of : +22,2, с = 1X. (пиридин).

Пример 3. 3-/М-/фурил-2 —

20 метоксикарбонил/-L-аланилокси/-индол.

Для взаимодействия по способу активного сложного эфира 4,26 г (0,02 моль) N-/фурия-2 /-метоксикарбонил/-L-аланина и 5,4 r (0,04 моль)

N-окси-бенэотриазола растворяют в

50 мл абсолютного тетрагидрофурана (ТГФ), охлаждают до 0 С и смешивают с раствором 4,4 r (0,022 моль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в 10 мл абсолютного ТГФ. Для образования активного сложного эфира реакционную смесь перемешивают 1,5 ч при 0 С, затем 2 ч при комнатной температуре.

Затем в отсутствие влаги и кислорода добавляют 2,66 r (0,02 моль) индокси-35 ла и 2,77 r (0,04 моль) абсолютного триэтиламина. Смесь перемешивают в течение 18 ч при комнатной температуре. Образовавшуюся N,N -дицикломочевину отсасывают, растворитель отгоня- 0 ют в вакууме и остаток обрабатывают по примеру 7, Аморфный сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на колонке с силикагелем с помощью смеси толуол — уксусный эфир (5: 1). После концентрирования соответствующих собранных фракций и перекристаллизации из смеси уксусного эфира с петролейным эфиром (1:1) получают 3,0 г (45,7Ж) 3-/N-/фурил- 50

/2 /-метоксикарбонил/-L-аланилокси/индола бесцветные кристаллы, т.пл.

129 С; с 1, . -51,9 ., с = 17 (метанол)..

Аналогично взаимодействием соответственно замещенных аминокислот .53 или пептидов с соответствующими ичдоксильными соединениями получают следующие вещества:

3. 1 3-/N-/толуол-4 -сульфонил-L-валилокси/-индол, бесцветье кристаллы, т.пл . 125-127 С; 4 ".: -24,5, с = 1X (метанол);

3.2 3-/N-/4 -диметиламино-бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол; аморфный слабо красноватый порошок; ТХ: готовая пластина силик геля, элюирукицее средство толуол-диоксан 3:1, индикация: УФ, NH,(ãàý), Rf — значение 0,25, 3.3 3-/К-/4 -ацетил-бензолсульфонил/L-аланилокси/-индол;

3,4 3-/N/4 -метоксикарбонил-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бес, цветные кристаллы, т.пл. 140-141 С;

d > . -40,3, с = 1 (метанол);

3.5 3-/N-/4 -карбоксиметил-бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, аморф ная бесцветная пена; с : -82, 1, с = 1X (метанол), ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство изопропанол-н-бутилацетат-вода

5:3:2, индикация: УФ, NH,(газ), Rf — значение 0,68, 3,6 Э-/N-/4 -карбоксиметокси-бенэолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, аморфная бесцветная пена, P . -47,7, с = 17 (метанол),.ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксан-ледяная уксусная кислота 6:2:1, индикация: УФ, NH,|.ràý), Kf - значение 0,27;

3.7 3-/К-/4 -карбоксиметиламино-бензолсульфонил/-Ь-аланилокси/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл. 151153 С (разложение);of . -71,5 с = 1X (метанол) !

3.8 3-/N-/4 -бензилоксикарбонил-метиламино/-бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол, бесцветные кристал|ы T.пл 110 113 С c4> . 60 0, с = 1X (метанол);

3,9 3-/N-/4 -фтор-бензолсульфонил/L-аланилокси/-индол, бесцветные крист у т пл 94-95 C»Ф Ы23 . -4895 1 с = 1X (метанол);

3. 10 3-/М-/4 -фторсульфонил-бензолсульфонил/-L-аланилокси/-индол

У

3. 11 Э-/N-/4 -сульфамоил-бенэолсульфонил/-L-аланилокси/-индол;

Э. 12 3-/N-ацетил-N-/толуол-4 -сульфонил/-Е-аланилокси/-индол, бесцветный аморфньФ порошок; of -10,6, с = 1Ж (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-диоксана

9:1, индикация: УФ, ИН,(газ), Rf— значение 0,17.

1156595

3. 13 3-/N-/Пиридин-3 -сульфонил/-1аланиловки/-индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 155-157 С; а : -55, 1 с 17 (метанол);

3.14 3-/N-/5, 5 -диметил-3 -оксоциклогексен-1,-ил/-L-аланилокси/индол, бесцветные кристаллы, т.пл, 154 С; оС 1 : -272,2, с = 1X (метанол);

3. 15 3-/N /ди-/4 -нитробензил/-фосфорил/-L-аланилокси/-индол;

: 3.16 3-/N-/ди-/4 -бромбензил/-фосфорил/-L-аланилокси/-индол;

17 3-/М/толуол-4-сульфонил/-1.—, ° 15 аланилокси/-5-метокси-индол;бесцветное вязкое масло; о(: -46,8, с = 1 (метанол).

ТХ: готовая пластина силикагеля, элюирующее средство толуол-этилацетат

2: 1, индикация: УФ, NH,(ãàç), Rf— значение 0,45.

Пример 4. 3-/N-/3, б -Диокса-н-гептилокси-карбонил/-Ь-аланилокси/-индол.

Для взаимодействия по способу сме шанного ангидрида 3,52 г (0,015 моль)

-Н-/З,б-диокса-н-гептилокси-карбонил/-L-аланина растворяют в 35 мл абсолютного тетрагидрофурана (ТГФ).

После добавки 2,1 мл (0,015 моль) триэтиламина смесь охлаждают до

-15 С, затем для получения смешанного ангидрида смешивают с 1,43 мл (0,015 моль) этилхлорформиата. После перемешивания в течение 1 ч при 35

"15 С в отсутствие кислорода и влаги добавляют охлажденный до -15 С раствор 2,00 (0,015 моль) индоксила в

20 мл абсолютного ТГФ. Смесь перемешивают следующие 2 ч при (-15 С) — 4д (-20 С) и затем оставляют на ночь в холодильнике. Отсасывают образовавшийся триэтиламиногидрохлорид, растворитель удаляют в вакууме и остаток обрабатывают по примеру 7. 4

Аморфный сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле сначала смесью . хлористый . метилен-- метанол (95:5), затем смесью толуол — металатилкетон (1:2), >О

После обработки собранных фракций активным углем и удаления растворителя получают 0,51 г (9,5X) 3-N-(3, 6 -диокса-н-гептилокси-карбонил/-1,— ! аланилокси/-индола, бесцветного вязкого масла; cL : -40, с =. 17 (метанол); ТХ: готовая пластина силикагеЛя, элюирующее средство толуол-метилэтилкетон 1:2, индикация: УФ, NH,(ãaý), Rf — значение 0,54.

Аналогично взаимодействием соответственно замещенных аминокислот с соответствующими индоксильными соединениями получают следующие вещества:

4.1 3-/И-2 -нитро-бензолсульфенил/Ь-аланилокси/-индол желтые кристаллы, т.пл. 133-134 С; с1 ;: -116,0, с = 1R (метанол);

4.2 3-/N-/t -метил-2 -бензоил-винил/L-аланилокси/-индол, слабо красноватые кристаллы, т.пл, 130-133 С; ТХ: готовая пластина силикагеля; элюирующее средство толуол-диоксан 4:1, индикация: УФ, NH,(ãàç), Rf — значение 0,45.

Соединения формулы Х служат для получения диагностичных средств для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности в жидкостях организма. Эти средства позволяют быстро и просто проводить диагностику.

Данные о свойствах полученных соединений. В качестве хромогенов индоксильные или тиоиндоксильные сложные эфиры аминокислот и пептидов общей формулы I используются в концентрациях 10 — 1 моль/л, предпочтитель-3 -М но 10 — 10 моль/л пропиточного раствора, наносимой массы или исследуемой жидкости.

Другой составной частью диагности" ческого средства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности протеаз лейкоцитов, является пригодная буферная система, например фосфатный, боратный, барбитуратный, трис-/оксиметил/- аминометановый -трис-/2-амино-2-метил-пропандиол-1,3-овый/=/амедиоловый/ или аминокнслотный буфер, причем рН и объем нужно выбирать так, чтобы в измеряемом растворе или на тест-полосах устанавливалось рН 6-10, предпочтительно 7-9.

При приготовлении диагностического средства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности з лейкоцитных протеаз в жидкостях организма, можно дополнительно применять окислитель, чтобы превращать первично образующиеся при ферментативной реакции индоксильные или тиоиндоксильные соединения в окрашенные индигоили тиоиндиго-вещества, Эти окислители, например гексапианоферрат-(III) 15

1 156595

Диаг ностичегкое средство для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз, в форме порошкообраэных смесей

S или таблеток реактивов можно изготовлять так, что указанные составные части теста смешивают с обычными галеновыми добавками и гранулируют.

Добавками такого рода являются, О например, углеводы, например моноУ олиго- или полисахариды, или сахарные спирты, например маннит, сорбит или ксилит, или другие растворимые инертные соединения, как полиэтилен5 гликоли или поливинилпирролидон. Порошкообразные смеси или реактивные таблетки обладают конечным весом примерно 50-200 мг-, предпочтительно

50-80 мг.

20 Для приготовления лиофилизатов с общим весом примерно 5-20 мг, предпочтительно примерно 10 мг, высушивают вымораживанием раствор, который содержит наряду со всеми необходи25 мыми для теста реактивами обычные образователи каркаса, например поливикилпирролидон, и при известных условиях другие наполнители, например -.аннит, сорбит или ксилит. калия, бромат калия, хромат калия. феназин-метосульфат или соли тетраолия, применяются в концентрациях

1Π— 1 моль/л предпочтительно

-3

У

10 — 10 моль/л раствора для пропитки, наносимой массы или исследуемой жидкости, Составной частью диагностического средства для обнаружения протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз, может быть смачиватель, так как при этом достигается сокращение времени реакций и лучшая окраска. Предпочтительно используются неионогенные, однако также амфотерные, катионо- или анионоактивные смачиватели в концентрациях

0,05 — 27., предпочтительно 0,1-17.

Для приготовления предлагаемого диагностического средства, например поглощающий носитель, предпочтительно фильтровальную бумагу, целлюлозу или прочее иэ синтетических волокон, пропитывают растворами обычно применяемымх для приготовления тест-полос реактивов (субстрат, буфер, при изBpcTHblx условиях смачиватель, окислитель и т,д.) в легколетучих растворителях, например вода, метанол, этанол или ацетон. Это целесообраз- 30 но осуществлять в две раздельные

1 стадии: сначала пропитывают водным раствором, который содержит буфер и другие водорастворимые добавки, затем раствором субстрата протеазы об- 35 щей формулы I. В специальных случаях можно также применять обратную последовательность пропитки.

Готовую тест-бумагу можно применять как таковую или приклеивать на держатели (an briffen) или предпочтительно запечатывать между пластмассами и мелкоячеистыми сетками.

Для приготовления покрытых пленкой4 тест-полос все реактивы вносят в раствор или дисперсию пленкообразующего вещества, например поливинилового эфира или полиамида, и гомогенно смешивают, Смесь наносят тонким 5Е слоем на пластмассовый носитель и высушивают. Предлагаемые покрьггые пленкой тест-полосы после высушивания разрезают и их можно применять как таковые или известным,образом 5> их наклеивают на держатеди или на1 пример, запечатывают между пластмассами и мелкоячеистыми сетками.

Диагностическое средство в форме раствора содержит предпочтительно все необходимые для теста реактивы.

В качестве растворителей принимают во внимание воду или смесь воды с водорастворимыми органическими растворителями, например метанол этанол

Э 1 ацетон или диметилформамид. Для устойчивости (при хранении) можно рас.пределять необходимые для теста реактивы на два или более растворов которые объединяют вместе лишь при непосредственном исследовании.

Таким образом, полученные диагностические средства позволяют обнаруживать наличие протеолитических ферментов, в особенности лейкоцитных протеаз. Образовавшуюся окраску можно оценивать визуально или фотометрически, например ремиссионнофотометрически или в кювете. Так как активность лейкоцитных протеаз на клетку можно рассматривать по существу как постоянную величину то на интенсивности образования окраски можно определять концентрацию лейкоцитов в исследуемой жидкости организма. При этом с помощью пред1156595

17 ся.

Составитель И. Бочарова

Редактор О. Колесникова Техред С.Мигунова Корректор М. Демчик

Заказ 3202/57 Тираж 384

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

/ по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Подписное

Филиал PTIIT "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 лагаемого диагностического средства охватываются интактные и лизированные лейкоциты, так как активность лейкоцитныг: протеаз также после лизиса лейкоцитов полностью сохраняет.