Способ получения рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО-JФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА путем.гомогенизации листьев в буфере, многократного фракционирования сульфатом .аммония, диализа н ионообмен- I ной хроматографии на ДЗАЭ-целлкотозе, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве буфера использзтот трис-HClj экстракт двзгкратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 3767% , активную фракцию фермента прогревают , проводят диализ против дистиллированной воды -однократно в те- . чение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 40-85%, а ионообменную хроматографию проводят однократно.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Ми) С 2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ й)СУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3571223/28-! 3 (22) 25,02.83 (46) 07.07.85. Бюл. В 25 (72) В.В. Иванищев, И.К. Хасанов, Ю.Д. Ахмедов и Ю.С..Насыров (71) Институт физиологии и биофизики растений АН Таджикской ССР (53) 663.53(088,8) (56) Rufner А.С. Spinach 5-phosphoribose isornerase. Purification and

properties of the eugynie. — "Biochemistry", 1970, v. 9, N 1, р. 178-.184. (54).(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО- э- .

ФОСФАТ ИЗОИЕРАЗЦ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА путем.гомогениэации листьев в буфере, „„SU„„1165713 А многократного фракционирования суль" фатои .аммония, диализа и ионообиен ной-хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ° отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве буфера используют трис-HCl экстракт двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 3767%, активную фракцию фермента прогревают, проводят диализ против дистиллированной воды однократно в течение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аимония при насыщении

40-85%, а ионообиенную хроматографию проводят однократно.

1165713

Изобретение относится к производству ферментов, касается технологии их получения, и может быть использовано для получения рибозо-5-фосфата, а также при моделировании системы 5 карбоксилирующей фазы фотосинтеза.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

П р и и е р. 100 г листьев шпина- 1О та промывают охлажденной водой, затем дистиллированной водой и подсушивают с помощью фильтровальной бумаги. Приливают 100.хп 0,05 N трис-НС1 буфера рН 8,5и гомогеиезируютв ступ- 15 ке или гомогенизаторе PT-1, полученный гомогенат фильтруют через четыре слоя марли. Добавляют к нему твердый сульфат аммония из расчета 23 r на

100 мл полученного гомогената. После 20 растворения сульфата аммония гомогенат центрифугируют на центрифуге (любой) при 8000 g в течение 25-30 мин.

Полученный осадок отбрасывают, а в супернатант добавляют твердый суль- 25

4®т аммония из расчета 19 г íà 100 мл супернатанта.

После растворения сульфата аммония помутневший супернатант вновь центрифугируют при 8000 g в течение 25- 3р

30 .мин. Полученный супернатант отбра сывают, а осадок растворяют в дистиллированной воде из расчета 65 мл на 100 г взятых листьев. Полученный раствор (70 мп) прогревают на водяной бане 95 С 1-1,5 мин, чтобы температура раствора достигла 60 С, и выдерживают в течение 10 мин в бане

60 С. Затем быстро охлаждают в ледяной бане до +4 С и центрифугируют gp при 8000 g в течение 20-25 мин на любой центрифуге. Полученный осадок отбрасывают, а супернатант диализуют в диализных мешках против 10-12 л дистиллированной воды (воду по 1,52 л меняют 6-8 раз s течение 40 ч).

Помутневший раствор насыщают твердым сульфатом аммония .из расчета

29 r на 100 мл, затем центрифугируют при 8000 g в течение 25-30 мин.

Осадок отбрасывают, а супернатант вновь насыщают сульфатом аммония из расчета 32 r на 100 мл. Вновь центрифугируют при тех же условиях.

Полученный осадок растворяют в минимальном .(3-5 мл) объеме 0,02 М трис-НС1 буфера рН 8-8,5 и обессоливают, используя диализ против

0,02 М трис-НС1 буфера рН 8,0 или, что лучше — обессоливают на колонке 1,5х25 см, заполненной сефадексом = 50 и забуференной тем же буфером. Обессоленный белок наносят на колонку с предварительно обработанной и забуференной ДЭАЭ-целлюлозой 0,02 М трис-НС1 åðîì рН 8,0.

После связывания беж с целлюлозой пропускают градиент концентраций

NaC1 0-0,5 И в том же буфере общим объемом 300 мл (на колонку 2,5х15 см) °

Активные фракции появляются после прохождения примерно 150 мл градиента. Все остальные фракции (примерно

150 мл) объединяют и приливают к ним. насыщенный раствор сульфата аммония 350 мл, предварительно оттитрованный аммиачной водой до рН 7,5.

Помутневший раствор центрифугируют.

Полученный осадок — очищенная рибозо-5-фосфат изомераза может быть растворена в буфере, обессолена и использована для дальнейшей работы (ее практического применения). Выход составляет 1-2 мг.

В таблице представлены сравнительные данные для предлагаемого и известного способов.

Полученный ферментный препарат характеризуется электрофоретической однородностью в 5Х 7,5Х и 10Х-ном полиакриламидном гелях, имеет характерную молекулярную массу в

53 000 дальтон и близкий аминокислотный состав к ферменту из табака, Таким образом, предлагаемый способ выделения рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината позволяет получать однородный высокоактивный ферментный препарат со значительно меньшими затратами во времени и реактивах по сравнению с известным способом.

1165713

Критерий

Количество затраченного времени, ч

60,65

2,1 раза

125,5

1,4

0,24

5,83 раза

Электрофоретическая однородность

Удельная активность, нкат/мг белка

1500

1500

400

5 раз

Составигель И. Гуляева

Техред:О. .Неце

Корректор С. Шекиар

Редактор В. Данко

Заказ 4285/24 . Тирах 525

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Ваушская наб., д, 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Уагород, ул. Проектная, 4

Количество очищенного фермента на 100 г листьев, мг

Количество растительного материала для получения

1 мг очищенного фермента, г/листьев

Известный Предлагаемый

Эффективность предлагаемого способа