Способ получения нуклеазы @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ S из амшторизина, включакиций стадии экстракции, термообработки, фракционирования сульфатом аммония, диализа, хроматографии на диэтиламиноэтилцеллкшозе , 1сонцентрирования, гель-фильтрация на сефадексе Г-75 и повторного концентрирования, отличающийся тем, что, с целью увеличения чистоты целевого продукта и упрощения способа, после диализа раствор нуклеазы депигментируют Активированным углем, при хроматографии на диэтилa в нoэтилцeллк пe зe сорбцию осуществляют S 0,05-0, ацетата аммония с рН 5,2-5,6, адесорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью

(19) 01) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

4(51) С 2 22

Ц|

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTGPCHOIVlV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ilO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3627093/28-13 (22) 11.04.83 (46) 15.06.85. Бюл. У 22 (72) А.А.Зейдака, M.À.Íåéìàíå, Л.Л.Полякова, А.А.Миериня, Л.А.Орна, В.ВеТарасевич и И.К.Шпрунка (53) 577. 15(088.8) (56) 1. Абрамов Р.E., Безирджан Х.О., Акопян Ж.И., Нуклеаза из Aspergillus

oryzae специфическая к однонитьевым участкам .нуклеиновых кислот. — "Биохимия", 1979; т. 44, Ф 6, с.990-995.

" 2. Сенченко В.И., Колбановская E.Î., Бочаров А.А. Получение .и некоторые характеристики функционально гомогенного препарата нуклеазы

Б р из амилоризина. — "Мол.Биология", 1979, т. 13, У 6, с. 1377-1383. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕАЗЫ

$б из амилоризина, включающий стадии экстракции, термообработкн, фракционнрования сульфатом. аммония, диализа, хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирования, гель-фильтрации на сефадексе -75 и повторного концентрирования, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью увеличения чистоты целевого продукта и упрощения способа, после диализа раствор нуклеазы депигментируют активированным углем, нри хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе сорбцию осуществляют в 0 05-0,075 И ацетата аммония с рН 5,2-5,6, а десорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью (12-14)н х10 см м .для отделения балластных белков, а затем с электропроводнос° 4 тью (23-30) 10 смм для элюции нуклеазы, концентрирование проводят ультрермльтрецззр через мембрану мз Ы сополимера метилметакрилата и hl-ви- С" нилпиролидона с радиусом пор 50 150 мкм, а повторное концентрирова" . ние- — диализом против 45-60Х-ного раствора глицерина. аминоэтилцеллюлозе сорбцию осуществляют в 0,05-0,075 И ацетате аммония с рН 5,2-5,6, а десорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью (12-14)М

«10 см м для отделения балластных белков, а затем с электропроводностью (23-30) «1О см м " для элюций нуклеазы, концентрирование проводят !

О ультрафиль.рацией через мембрану из сополимера метилметакрилата и N-винилпиролидона с радиусом пор 50 l50 мкм, а повторное концентрирование — диалиэом против 45-60 .o-ного

15 раствора глицерина.

Сущность способа заключается в следующем.

Амилоризин зкстрагируют буфером ацетата натрия рН 4,6 и экстракт

20 подвергают термообработке при 70©С, проводят осаждение сульфатом аммония при 70 и 100 насыщения, осадок растворяют, диализируют и проводят депигментацию активированным углем, 2S очистку нуклеазы Б„ продолжают сорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе в стационарном режиме в буфере ацетата аммония рН 5,2-5,6 и злюцией буферами повышенной ионной силы с удельной электропроводимостью (12-14) ° 10 см.м 1, (23-30) 10 см м . Концентрируют раствор фильтрацией через мембрану Ринор с радиусом пор 50-150 мкм, хроматографируют на сефадексе Г-75, и.конечный продукт стабилизируют диализом против 45-60 .-ного раствора глицерина.

1 11615

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к способу по" лучения нуклеазы S (ÊÔ 3.1,30.1, одноцепочной нуклеинат-5 -олигонуклеои тид-гидролазы), применяемой в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновых кислот и рибонуклеиновых кислот. Фермент также применяется в генетической инженерии при получении рекомбинатных ДНК.

Известен способ получения нуклеа- . зы Б„, основанный на использовании ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе (1j .

Однако из-за недостаточной очистки препарат содержит примесь других ферментов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигае-, мому положительному эффекту является способ получения нуклеазы Зу иэ, амилоризина, включающий стадии экстракции, термообработки, фракциониронания сульфатом аммония, диалиэа, хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирования, гельфильтрации на сефадексе Г-75 и повторного концентрирования, причем концентрирование приводится с помощью хроматографии на ДЭ-32 (3-кратной). Способ включает также стадию хроматографии на сульфо-сефадексе (2) .

Недостатками способа являются его сложность (16 стадий, причем 6 из них — хроматография на ионообменни ках), использование импортных сор" бентов (ДЭ-32 фирмы "Ватман", сульфосефадекс и сефадекс Г-?5 фирмы

"Partaacia"), а также неполное отде" ление от загрязняющих целевой продукт ферментов.

Цель изобретения " увеличение чистоты целевого продукта и упроще" 45 ние способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения нуклеазы S.I из амилоризина, включающему стадии экстракцни, термообра- 59 ботки, фракционирования сульфатом аммония„ диализа, хроматографии на дяэтиламиноэтилцеллюлоэе„ концентрирования, гель"фильтрацйи на сефадексе Г-75 и повторного концейтри- 55 рования, после диализа раствор нук" леазы депигментируют активированнъак углем, при хроматографии иа диэтил50 г

В результате отделяется основная масса пигмента и связанного с ним белка. Удельная активность при этом повышается в 1,5-3 раза. Удаление ниэкомолекулярных белков позволяет более эффективно проводить хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и экономить материалы, в том числе ДЭАЭ-целлюлозу. На том же количестве ДЭАЭ-целлюлозы и сефадекса Г-75 можно осуществить разделение в 1,5-3 раза больших количеств фермента.

Сорбцию Я„ проводят на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,05-0,075 буферои ацетата аммония рН 5,2-5,б, что позволяет получить более хорошее отделение примесей РНКаз. Использованне буфера ацетата аммония по сравнению с буфером ацетата натрия вызывает улучшенное разделение бел3 1 1615 коной смеси и способствует получению нуклеазы S высокого качества.

Концентрирование образцов ультрафильтрацией обеспечивает дополнительную очистку (отделение низкомолеку- 5 лярных веществ), при этом активность нуклеазы S сохраняется на 80-100Х и из процесса очистки исключается диализ нли разбавление раствора с целью получения раствора с более низкой 10 электропроводностью, необходимое для сорбции на анионитах.

Концентрирование образцов диализом против 45-50Х-ного раствора глицерина позволяет обеспечить процесс f5 концентрирования и стабилизацию препаратов нуклеазы S„. Объем раствора нуклеазы Б„ снижается в 2-3 раза.

Упрощение процесса достигается включением в технологию очистки ста- 20 дий, позволяющих улучшить контроль процесса н ускорить проведение отдельных стадий очистки.

Замена стадий концентрирования на ДЭ-32-целлюлозы концентрировани- 25 ем на ультрафнльтрах и диализом против глицерина, а также исключение хроматографии на сульфо-сефадексе . позволяет сократить число стадий с

16 до 14. В результате получают ре- ЗО парат с удельной активностью 20,00070.0дО ед/мг белка, выход 17Х, практически не содержащий примеси нее специфических фосфатаз, фосфодиэстераз и экзонуклеаз.

Пример 1. 160 г амилоризина экстрагируют 1,6 л 0,02 М буфера ацетата натрия, содержащим 0;05 М

NaC1 и 0,1 мМ Е и + . Осадок отделяют центрифугированием. Экстракт подвер- 4б гают термообработке, постепенно повышая температуру раствора до 70 С в водяной бане с температурой 75ОС. К раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,7 (800 г), перемешивают и осадок отделяют центрифугированием. К центрифугату добавляют

320 г сульфата аммония (насыщение

i,0) и после формирования осадка отделяют осадок центрифугированием, растворяют и проводят диализ против деминерализоваиной воды. К диализату добавляют ЗХ по объему активированного угля и перемешивают 30-40 мин .о лри 4 С. Уголь удаляют фильтрацией через ватный порошок и разбавляют в

2 раза 0,05 М буферным раствором уксуснокислого аммония рН 5,2, содер50 4 жащего 0,1 мИ ионов цинка. К раствору добавляют ДЭАЭ-целлюлоз- (1 г на

100 мг белка) и перемешивают 20 мпн, ДЭАЭ-целлюлозу отделяют фильтрацией, суспендируют в 0,05 М буфере ацетата аммония рН 5,2 и переносят в колонку (4 25 см). Колонку промывают раствором ацетата аммония рН 5,2 с удель-1 ной электропроводностью 12 ° 1(7 см.м и фермент элюируют буферным раствором ацетата аммония рН 5,2, содержащего 0,1 мМ ионов цинка с удельной электропроводимостью 23 ° 10 5см.м .

Раствор нуклеазы S фильтруют че 1 реэ мембрану Рипор-4 с радиусом пор

50-100 мкм до объема 20 мл и наносят на колонку с сефадексом Г-75 (4 » х100 см), уравновешенной буфером ацетата натрия рН 4,6, содержащего

0,1 мМ ионов цинка. Активные фракции объединяют и двухкратно диализируют при постоянном перемешивании при 44 С в течение 1 ч против 50Хного раствора глицерина (соотношение диализируемого раствора и диализирующего раствора — 1:10 по объему).

Достигается 3-кратное концентри рование раствора и стабилизация нуклеаэы в растворе 50Х-ного глицерина.

В результате получают препарат нуклеаза $„ с активностью 10000 ед/мл, удельйой активностью 30.000 ед/мг белка. Фермент при проверке вызывает расщепление суйерспиральной ДНК плаз-. миды pBR 322 и образование кольцевой и линейной формы ДНК. На электрофореграмме не наблюдаются размытые зоны продуктов расщепления ДНК, появление которых свидетельствует о наличии примесей эндонуклеаз. Выход составляет 17Х. Препарат нуклеазы S также не содержит примесей неспецифических: фосфатазы и фосфодиэкстераэы (субстраты и-нитрофенилфосфат и кальциевая соль бис-п-.íèòðîôåíèëôîñфат).

Активность нуклеазы 8, определена по расщеплению ферментом денатурированной ДИК при рН 4,6. 3a единицу активности принимают количество фермента, которое катализирует гид1ролиз 1 Mr денатирурованной дезоксирибонуклеиновой кислоты за 1 мин при 37оС и рН 4,6

Пример 2. 0,7 кг амилоризи- на экстрагируют 7 л буфера ацетата натрия, проводят термообработку, вЫсаливание сульфатом аммония, диализ

ЯЯИИИ Заказ 3938/31

Тираж 525 Подписыое

ЭФ ° ЮФФЮЮЮ Ф

Филвай ППП ®Щтеат", t,Óâãoðîä, ул.Проектная, 4

5 11615

: и депигментацию, как в примере 1. К

- раствору, полученному при депигментации„ добавляют ДЗАЭ-целлюлозу (волокнистую), уравновешенную

: 0,075 M буфером ацетата аммония рН 3

5,6, перемешивают и переносят в колонку (10425 см), как описано в примере l. Злюцию проводят буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мИ ионов цинка и удельную электропроводимость 14х10 см,м и буфером с электропроводимостью 30 10 см,м ".

Активные фракции объединяют и концентрируют ультрафильтрацией через мембрану Рипор-3 (радиус пор 100- 15

150 мкм) до объема 100 мп, наносят по порциям 20 мл на колонку с сефадексом Г-?5 и проводят хроматографию, как описано в примере 1. Активные фракции объединяют и проводят 26 концентрирование раствора диализом против 60 -ного глицерина, как описано в примере 1. В результате получают 200 мл раствора нуклеазы S„ в 60%-ном растворе глицерина с ак- И тивностью 21.000 ед/мл и удельной активностью 53.300 ед/мл. Выход составляет 20Х по активности.

Пример 3. 0,16 кг амилоризина экстрагируют 1,6 л буфера аце- щ тата натрия, проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диалиэ н депигментацию, как в примере 1. K раствору, полученному при депигментации, добавляют ДЭАЭ-целлю- ® ,лозу, уравновешенную 0,055 И буфером ацетата аммония рН 5,5, промывают и переносят в колонку, как описано в примере 1. Злюнруют колонку буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мМ р . ионы цинка, с удельной злектропроводностью 13 ° 10 см.м "и 27 10 см.м .

Активные фракции объединяют и проводят ультрафильтрацию и гель-хромато" графию, как описано в примере 1. Раст- вор нуклеаэы Я„,:полученный при гельхроматографии, концентрируют диализом против 50Е-ного раствора глицерина в буфере. В результате получают

12 мл раствора 3„ с активностью

31.000 ед/мл и удельной активностью

50 6

70.000 ед/мг белка. Выход по активности составляет 21Х.

Пример 4. 0,16 кг амилоризина экстрагируют 0,16 л буфера ацетата натрия и проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диализ, депигментацню, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацию и хроматографию на сефадексе

Г-75, как в примере 1. Активные фракции, полученные при гель-фильтрации

1(60 мл}, диализируют двухкратно при постоянном перемешиванин против

45 -ного раствора глицерина. В ре" зультате получают 28 мл раствора нуклеазы Я„ с активностью 18.000 ед/мл, удельной активностью 27 .000 ед/мг и выходом 20 . При проведении хроматографии при концентрации солей ниже

0,05 М рН 5,2-5,6 наблюдается снижение стабильности фермента, а при концентрации выше 0,1 И часть фермента при рН 5,2-5,6 не сорбнруется.

Значение рН 5,2-5,6 при хроматографии на ДЗАЭ-целйюлозе обеспечивает высокую степень очистки, выход фермента и максимальное отделение прнмесных РНКаэ. При рН 5,0 снижается эффективность сорбции нуклеаэы, а при рН 5,9 и 7,0 в соответственно в

1,5 и 2,0 возрастает количество примеси РНКаз после хроматографии.

Таким образом, изобретение обес;течивает получение препарата нуклеаэы Б высокого качества эа счет увеличения его чистоты, а также упрощение способа за счет сокращения чис- ч ла стадий с 16 до 14 и облегчения проведения хроматографии и контроля за ней путем введения ступенчатой злюции фермента, Кроме того, способ позволяет получать фермент без использования импортной

ДЭАЭ-целлюлозы фирмы "Ватман".

Себестоимость препарата составляет О, 18 р. за 1000 ед. активности по сравнению с 0,82 р. за препарат, выпускаемый.на НПО "Биохимреактив".

Препарат по качеству соответствует препаратам фирмы Sigma, P-L Biochemicals и др.