Способ выделения моноаминоксидазы

 

СНОСОВ ВЫДЕЛЕНИЯ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ из мозга путем солюбилиэахщи митохондрий неиЬиным детергентом и аффинной хроматографии, о тличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, солюбилизацию проводят в 0,01-0,05 М фосфатном буфере рН 7,2-7,6 с последующей биоспецифической хроматографией в объеме.

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

ООН МОЮ . РЕСПУБЛИН ((9) (l l) 4(5цС 12 N9 00

ГООУДАРСТВЕННЬЙ НОМИТЕТ ССОР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЬЙ

, с 3,2" .. °

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: " :: .Н ASTOPQHOMV СИИДВТВЪСТВ\Г

Ф\

° Ю

° ю

Ъ\ (21) 3599395/28-13 (22) 03.06.83 (46) 07.07.85. Бюп. В 25 (72) Т.А. Москвитина, Н.Е. Кучина и В.3. Горкин (71) Институт биологической и медицинской химии АИН СССР (53) 612.015. 1(088.8) (5á) "Prepar. Biochem",, 1979, ч. 9, У 2, р. 171-196, (54) (57) СИОС0Б ВЫДБЛКНИЯ МоноАМИН0

КСИДАЗЫ из мозга бьща путем солюбилизации митохондрий неионным детерген том и аффинной хроматографии, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, солюбилизацию проводят в 0,01-0,05 И фосфатном буфере рН 7,2-7,6 с последующей биоспецифической хроматографией "в объеме".

1 1165

Изобретение относится к биохимии и медицине, а именно к способам выделения высокоочнщенных ферментных препаратов, конкретно к способам выделения фермента моноаминоксидазы (МАО) из объектов животного происхождения, и может быть использовано в научных целях, применяться в лабораторной и медицинской практике.

Цель изобретения — упрощение про- 0 цесса и увеличение выхода целевого продукта.

Пример 1. 500 r мозга быка промывают 0,9 КС1 и гомогенизируют в течение 1 мин при 8000 об/мин 15 (гомогеннзатор PT-1) с 4500 мл

0,25 М сахарозы, к которой добавляют

90 мл 1И К,НРО до рН 7,2. Полученный гомогенат центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин на центрифуге ЦЛР. 20

Надосадочную жидкость (3350 мл) центрифугируют в течение 10 мин при

1300 g aa центрифуге ЦЛР для осаждения митохондрий. Осадок, полученный после центрифугирования при 25

1500 g втечение 10 мин, промывают

2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,2, и промывные воды центрифугируют при

13000 g в течение 10 мин. Полученные осадки митохондрий объединяют, сус- gp пендируют в 450 мл бидистиллированной воды и центрифугируют в течение

40 мин при 26000 g на центрифуге

ЦВР-1. Полученный осадок, содержащий мембраны митохондрий, промывают два раза 0,01 И фосфатным буфером, рН

2 ° 2, для удаления белков митохондрнального матрикса и суспендируют в минимальном объеме того же буфера.

В полученной суспензия определяют 40 содержание белка при помощи калори метрического метода Лоури.

Суспензию, содержавшую 18,4мг/мл белка в объеме 210 мл, центрифугируют 30 мин при 34000 8 на центрифу- 45

re ЦВР-1. Полученную надосадочную жидкость .отбрасывают, а к 130 мл осадка добавляют 257 мл 0,01 М фос:фатного буфера рН 7,2, содержавшего

18,8 мл 25Х-ного водного раствора 1 у детергента тритон х-100. При перемешйвании на холоду (О ) полученную .смесь выдерживают 30 мин, а затем центрифугируют при 40000 я в течение 1 ч. Полученную надосадочную у жидкость концентрируют методом ультрафильтрации через фильтр Амитон. РМ=ЗО до 34 мл. Всего получе714 . 2 но 456 г солюбиэированного материала, который на воронке со стеклянными фильтрами диаметром 9,6 см обрабатывают 188 мл адсорбента

АН-Сефарозы, уравновешенного 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2. Адсорбент промывают 600 мл этого же буфера, а препарат MAO-1 элюируют

0,1 М фосфатным буфером рН 7,2, собирая фракции по 30 мл. Те фракции, которые содержат белок (общий объем 175 мл), концентрируют в течение 18 ч при помощи Сефадекса Г-200 (сверхтонкий), а затем путем ультрафикации через фильтр Амикон PM-30 до объема 30 мл. Препараты МАО-Па элюируют как описано 0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,09Х тритон х-100; ИАО-Пб — указанным буфером, содержавшим 0,25 тритон х-100.

Регенерацию АН-Сефарозы осуществляют промывкой 0,4 М фосфатным буфером, содержавшим 1Х тритон Х-100 и 0,6 M NaC1, а затем 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,2.

П р н м е р 2. 500 r мозга быка промывают 0,9% КС1 и гомбгенизируют в течение 1 мин при 8000 об./мин (гомогениэатор PT-1) с 4500 мп

О, 25 М сахарозы, к которой добавляют

90 мл 1Yi К,НРО до рН 7,6. Полученный гомогенат центрифугируют прн

1500 g в течение 10 мин на центрифуге ЦЛР. Надосадочную жидкость (3350 мл) центрнфугируют в течение

10 мин при 1300 g на центрифуге ЦЛР для осаждений митохондрий. Осадок„ полученный после центрифугировання при 1500 g в течение 10 мин, промывают 2250 мл 0,25 М сахарозы, рН 7,6, промывные воды центрифугируют при

13000 g в течение 10 мин. Полученные осадки митохондрий объединяют, суспензируют в 450 мл бидистиллированной воды и центрифугируют, в течение 40 мин при 26000 g на центрифуге ЦВР-1. Полученный осадок, содержащий мембраны митохондрий, промывают два раза 0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6, для удаления белков митохондриального матрикса и суспензируют в минимальном объеме того же буфера. В полученной суспензии определяют содержание белка при помощи калориметрического метода Лоури.

Суспензию, содержавшую 20,5 мг/мл белка в объеме 188 мл, центрифугируют 30 мин при 34000 g на центрифу1165

Составитель Н. Земляк

Техред О. Неце Корректор В. Гнрняк

Редактор В. Данко

Заказ 4285/24 Тираж 525 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035. Москва, Ж-35,, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4 з

re ЦВР-1. Полученную надосадочную жидкость отбрасывают, а к 130 мл осадка добавляли 257 мп 0,01 М фосфатного буфера рН 7,6, содержавшего 18,8 мп 257;ного водного раствора детергента тритон х-100. При помешивании на холоду (О ) полученную смесь выдерживают 30 мин, а затем центрифугировали при 40000 g в течение 1 ч.

Полученную надосадочную жидкость кон- 10 центрируют методом ультафильтрации . через фильтр Амикон PM-30 до 34 мп.

Всего получено 464 мг солюбизированного материала, который на воронке со стеклянным фильтром диаметром

9,6 см обрабатывают 191 мп адсорбента АН-Сефарозы, уравновешенного

0,01 М фосфатным буфером, рН 7,6.

Адсорбент промывают 600 мл этого же буфера, а препарат ХАО-1 элюируют

714 4

0,1 М фосфатным буфером рН 7,6, собирая фракции по 30 мп. Те фракции, которые содержат белок (общий объем

170 мл), концентрируют в течение

18 ч при помощи Сефадекса Г-200 (сверхтонкий), а затем путем аультрафильтрации через фильтр Амикон

PM-30 до объема 30 мп. Препараты

МАО-Па элюируют таким же образом

0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 0,097. тритон х-100;. ИАО-йб— тем же буфером, содержавшим О, 14Х тритон х-100, а ИАО-III — 0,4 И фосфатным буфером, содержавшим 0,253 тритон х-100. Регенерацию АН-Сефарозы осуществляют промывкой 0 4 М фосфатным буфером, содержавшим 1Х тритон х-!00 и 0,6 М aCI а затем 0,01 M фосфатным буфером, рН 7,6.