Способ выделения фосфолипазы а2 из яда кобры

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ AJ , ИЗ ЯДА КОБРЫ, вк.гаочаюш;нй растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, выделе- / нием целевого продукта путем аффинной хроматографии, элюции и лиофилизации , отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьшения степени очистки целевого продукта, растворение проводят в 0,045-0,055 М буферном растворе уксуско-кислого аммония при рй 7,4-7,6, хроматограф1го осуществляют на пенткл-агарозе Б -r.oj же бу зерном растворе, а злюцию в 0,45-0,55 М растворе уксусно-кислого амьюния и лиофилизируют полученньм раствор двгкды. $

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1188948 А1 (Si)s А 61 К 37/48

ЯФ j .ipseö;„у "Etl) Щ(. 3.. -,. 1: э:

) ЯУ

Eve„: Л : ) 1-- «-.А 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМЪ/ СВИДЕТЕЛЬСТВУ аммония (удельная электропроводность реева

4,4 10 S см, рН 7,4) колонку с > ы пентил-агарозой (размеры колонки (2,1 16 см) наносят раствор яда. Ко-.. - у лонку элюируют с 0,045 М раствором ив уксусно-кислого аммония с удельной

«1 электропроводностью 4,4 10 3 S cu рН 7,4 со скоростью 30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата. регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд-11", Остальные компоненты яда кобры кроме „ ) фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаза А, имеющая оптимум гидрофобности и активно-.; сти при рН. 7,5, связывается на пеитил-агарозе и ее элюируют градиентом ионной силы концентрацией уксусноГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР(2)) 3718820/28-)4 (22) 02.04.84 (46) 30.11.90. Бюл. В 44 (71) Институт химической и бцологической физики АН ЭССР и Опытный завод органического синтеза и биопрепаратов Института химии АН ЭССР (72) А.А.Тара, Ю.P.Сийгур и А,А,Аавиксаар (53) 615.43:577.15,025.3 (088.8}

I (56) Ансалон У,P. „Шамборацт О.Г., Мирошников А.И. Биоорганическая хи мия 3 (II) 1553-1559, 1977. (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ

А ИЗ ЯДА КОБРЫ, вк.пючающий раствореИзобретение относится к ферментной промышленности, в частности к . получению чистой фосфолипазы А из яда кобры.

Целью изобретения является упрощение процесса и повышение степени очистки целевого продукта, Пример 1. К 1,0 г яда кобры добавляют 8,0 мл раствора 0,045 M уксусно-кислого аммония с удельной

-3 -1 электропроводностью 4,4 10 S см рН 7,4, смесь медленно перемешивают

4 ч при 40.С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С. в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, насадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную с 0,045 М раствором уксусно-кислого

2 нйе яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, выделе4 нием целевого продукта путем аффинной хроматографии, элюции и лиофилизации, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения степени очистки целевого продукта, растворение проводят в

0,045-0,055 М буферном растворе, уксусvo-: ñëoão ам юния при рН 7 4-7, 6 н. ую хромато раф го oc " щес твля ."т на пентил-агарозе и ". ам же буферном растворе, а этпоцик в 0,45-5.55 М растворе уксусно-кислого аз;ончя и лиафилизируют полученный раствор два-::цы.

1188948

15

25

Корректор Т,Малец.Заказ 4341 Тираж 542 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета,по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,- Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101 кислого аммония 0,45 М с удельной

-Э -1 электропроводность 32-10 S см рН 7,4. Фракции, имеющие фосфолипаэ-. ную активность, объединяют (выход

92 мл) и лиофилизируют дважды.

Характеристика препарата: выход

65,1 ., Степень очистки 25 раз. ...Пример 2. К 1,0 г яда кобры добавляют 8,0 мл раствора 0,050 М уксусно-кислого аммония с удельной

-Э электропроводностью 4,5 ° 10 S см рН 7,5, смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С, Растворенный о яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенную с 0;050 M раствором уксусно-кислого аммония (удельная ! . электропроводность 4,5 10 S см рН 7,5) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки 2,1»16 см) наносят раствор яда.

Колонку промывают с 0,050 M раствором уксусно-кислого аммония с . удельной электропроводностью 4,5 r

«10 S см, рН 7,5 со скоростью

30 мл/ч, отбирают фракции по 15 мл. 30 . Оптическую плотность элюата регистри- руют непрерывно с помощью "Увикорда11", Остальные компоненты яда кобры кроме фосфолипазы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаза 35

А, имеющая оптимум гидрофобности и активности при рН 7,5, связывается на пентил-агарозе и ее элюируют

0,50 М раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводно-, 40 стью 34 10 S см, pH 7,5. Фракции, имеющие фосфолипазную активность, объединяют. (объем 90 мл) и лиофилизируют дважды.

Выход препарата 65,3 и степень 45 очистки 25,2 раз, Редактор О,Филиппова Техред М.Дидык

Пример 3. К 1,0 r яда добавляют 8,0 мл раствора 0,055 М уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 4,6.10 S см, рН 7,6, смесь медленно перемешивают 4 ч при

4 С. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение

30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для хроматографии. На уравновешенйую с 0,055 M раствором уксусно-кислого аммония (удельная электропроводность 4,6»

»10 S см, рН 7,6) колонку с пентил-агарозой (размеры колонки 2,1»

F16) наносят раствор яда, Колонку промывают с 0,055 Р1 раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью 4,6 "

»10 S см, рН 7,6 со скоростью

30 мп/ч, собирают фракции по 15 мл.

Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "увикорда-11". Остальные компоненты яда кроме фосфолипаэы А в данных условиях проходят колонку, а фосфолипаsa А, имеющая оптимум гидрофобности и активности при рН 7,5 связывается на пентил-агароэу и ее элюируют

0,55 М раствором уксусно-кислого аммония с удельной электропроводностью

36,10"Э S см, pH 7,6. Фракции, содержащие фосфолипазную активность, объединяют (объем 92 мл) и лиофилизируют дважды.

Выход препарата 65,0 и степень очистки. 25 раз.

Технико-экономическая эффектив-. ность использования предлагаемого способа выражается в возможности количественного выделения фосфолипазы А из яда кобры простым и дешевым способом, а остальной яд без фосфолипазы А можно использовать для пой лучения других биоактивных белков или после высушивания сохранить.