Способ получения лизоцима
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА, , включакяций промывание клещей физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное замораживание гомогената, его нагревание, обрабртку фосфатом натрия, обессоливагние гельфильтрацией с последующей последовательной экстракцией спиртом, буфернЕлм раствором , дистиллированной водой и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности лизоцима, предварительно на клещей воздействуют монохроматическим поляризованным светом видимого диапазона с длиной волны 6328 А , мощностью 0,1250 ,50 мВт/см в течение 0,5-30 мин {С одно- TpexKjpaTjio с интервалом между обработками 2-6 ч, а промывку и по- C/J следующую обработку проводят через 1-120 ч после воздействия монохроматическим поляризованным светом.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
П9) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H ABTOPGH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
QCP(g)y p g
Р-Р ЕЦТ11 »
М,)
7ех Кц.(,,у ФД j (21) 3299414/28-13 .(22) 20.03.81 (46) 15.07.83. Бюл. Р 26 (72) В.М.Подборонов, В.П.Финник, Л.A.Êîðæåâåíêî, A.М.Подборонов и В.П.Финник (71) Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский инсти-тут эпидемиологии и микробиологии им. .Ф.Гамалеи АМН СССР (53) 615.45:663.33(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР
9 787998, кл. G 01 Н 33/48, 1979.
2. Подборонов В.М., Гроховская И.М
Степанченок-Рудник Г.Й. Получение и свойства бактерицидного вещества выделенного из клещей. Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 1975, с.716-719.
Д(51) A 61 К 35/56; A 61 К 37/48 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧБНИЯ ЛИЗОЦИМА, включающий промывание клещей физиологическим раствором, их гомогениэацию, многократное замораживание гомогената, его нагревание, обработку фосфатом натрия, обессолива. ние гельфильтрацией с последующей последовательной экстракцией спиртом, буферным раствором, дистиллированной водой и выделением целевого продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности лизоцима, предварительно на клещей воздействуют монохроматическим поляризованным светом видимого диапазона с длиной волны 6328 A мощностью 0,1250,50 мВт/см2 в течение 0,5-30 мин со одно- трехкратно с интервалом между обработками 2-6 ч, а промывку и последукбаую обработку проводят через
1-120 ч после воздействия монохроматическим поляризованным светом.
1028334
Изобретение относится к биологической промышленности, в частности к способам получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения.
Известен способ получения лизоцима из клещей путем помещения их перед выделением в постоянное поле напряженностью 25-600 Э на 1-48 ч $1 ), Однако известный способ длителен.
Известен также способ получения лизоцима, включающий промывание клещей физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное замораживание и размораживание гомогената, его нагревание, обработку фосфатом натрия, обессоливание гельфильтрацией с последующей последовательной экстракцией спиртом, буферным раствором, дистиллированной водой и выделением целевого продукта (2 1. 20
Однако известный способ не обеспечивает выход фермента достаточно высокой активности.
Целью изобретения является повышение активности лизоцима. 25
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения лизоцима, включающему промывание клещей физиологическим раствором, их гомогенизацию, многократное зама- . 30 раживание и размораживание гомогената, его нагревание, обработку фосфатом натрия, обессоливание гельфильт- рацией последовательной экстракцией спиртом, буферным раствором, дистил- 35 лированной водой и выделением целевого продукта, предварительно на клещей воздействуют монохроматическим поляризованным светом видимогo диапазона с длиной волны 6328 А, мощностью 0,125-0,50 мВт/см в течение 0,5-30 мин одно-трехкратно с интервалом между обработками 2-6 ч, а промывку и последующую обработку проводят через 1-120 ч после последнего воздействия монохроматическим поляризован IEiiM cspTQM, Пример 1. Клещей 0rnithodens
papi Efipes общей массой 900-1000 мг помещают в камеру и вносят их в зону 50 воздействия источника лазерного излучения видимого диапазона с длиной волны 6328 R мощностью 0,125 мВт/см в течение 45 мин однократно с после дующим выделением лизоцима.из органов через 1 ч после обработки. Подвергнутых лазерному воздействию клещей промывают 250 мл физиологического раствора, 50 мл спирта, а затем трижды промывают физиологическим раствором по 250 мл, гомогениэируют, добав-6О ляют дистиллированную воду в соот.ношении 1:4 таким образом, чтобы общий объем гомогената доходил до
90 мл, и доводят рН до 4,0 ледяной уксусной кислотой. Затем гомогенат 65
3-кратно замораживают и оттаивают до полного разрушения клеточной структуры тканей., Отделение сопутствующих. белков клещевого гомогената проводят нагреванием до 100@С в течение 3 мин с последующим быстрым охлаждением. К охлажденному гомогенату добавляют двузамещенный фосфат натрия до концентрации 0,1 М и доводят рН щелочью до 8,5,выпавший осадок отделяют центрифугированием в течение
10 мин со скоростью 9000 об/мин.
Центрифугаты обессоливают гельфильтрацией на сефадексе G-25„
Фракции, содержащие обессоленный раствор тканей клещей, собирают и лиофилизируют. В дальнейших исследованиях центрифугат фильтруют через стерильный ватно-марлевый тампон, упаривают на роторе, затем фильтруют и лиофилизируют. Полученный порошок растворяют в 5 мл физиологического раствора, добавляют восьмикратное количество спирта для выделения в осадок бактерицидного вещества, последнее экстрагируют подкисленным уксусной кислотой 60-градусным спиртом, буферным раствором, дистиллированной водой. Затем аморфный порошок, со держащий .бактерицидное вещество, растворяют в 10 мл разбавленной уксусной кислоты и высушивают на лиофильной сушке, после чего порошок растворяют в 10 мл 2 N ацетатного буфера, содержащего 53-ный раствор хлористого натрия, через 1-2 ч в осадок выпадает бактерицидное вещество (лизоцим). Выход биологически активного вещества (лизоцима) из
500 клещей массой 1000 мг составляет
5,6 мг., Активность выделенного бактерицидного вещества (лиэоцима) определяют методом диффузии в агаре.
Бактерицидное вещество, выделенное из клещей, диффундируя в стандартных условиях в агаре, лиэирует оболочки мертвых клеток М. {?ysodeiRticus, равномерно задитых в агаровые пластинки. В результате образуются различные зоны лиэиса, по диаметру которых судят об активности бактерицидного вещества.
Пример 2. Берут б групп клещей по 500 особей в группе. Клещи первой группы (контрольные) лазерной обработке не подвергают. На клещей 2. — б-й групп воздействуют источником лазерного излучения с длиной волны 6328 А, мощностью 1
0,125 мВт/см . На клещей 2-й группы воздействуют в течение 0,25 мин, 3-й — 0,50 мин, 4-й - 15 мин, 5-й
30 мин и б-й — 45 мин двукратно с интервалом между обработками 2 ч.
Получение лиэоцима из клещей этих групп осуществляют через 60 ч..1-028334
Пример 3.. Берут 6 групп кле- 0,25 мин., 3-й — 0,50 мин, 4-й-щей по 500 особей в каждой группе. 15 мин, 6-й — 45 мин, — двукратно с
Клещи 1-й группы (контрольные) об- интервалом между обработками 2 ч, работке лучами лазера не подвергают. получение лиэоцима осуществляют чеНа клещей 2 - 6-й групп воздействуют рез 60 ч ° источником лазерного излучения мощщей по 50(} особей в группе. Клещи первой группы (контрольные) обработ,ке не подвергают. Клещи 2-6-й групп !
3 0 мин и 6«й 4 5 мин Клещей (О 1подвергают обработке источником ланых групп обрабатывают двукратно с . зерного излучения мощностью
0,500 мВтусм . На клещей 2-й группы
О 5ОО В Н интервалом между обработками 2 ч, воздействуют в течение .0,25 мин, Получение лизоцима из клещей опытных и контрольной групп проводят через 3-й — ОР50 мину 4-й — 15 MHHt
60 ч. 5-й — 30 мин, и 6-й — 45 мин . двукратно с интервалом между обраР и м е Р 4. Берут 6 гРУпп кле- ботками 2 ч, получение лиэоцима осущей по 500 особей в группе. Клещей ществляется через 60 ч.
1-й группы не обрабатывают (контрольные) . На клещей 2,3,4,5 и 6-й Зависимость активности и выхода групп воздействуют источником лазер- 2О сухого вещества лизоцима от времени ного излучения мощностью 0,750 мВт/см и мощности лазерного облучения на клещей 2-й группы в течение (примеры 1-5) представлена в табл.1.
Таблица 1
«4
Предлагаемый способ
Известный способ
Показатели
Время действия на клещей, мин
30
0,25
0,50
Мощность облучения 0,125 мВт/см2
Выход сухоro в-ва, мг
5,2
0,5
5 к 1
5,2
5 3
5,2
Активность лизоцима,ЕД
2860+101 4040+115 4405+147 .6231+170 71902173 7700+185
Мощность облучения 0,250 мВт/см 2
I
Выход сухого в-ва, мг
5 0
5,4
5,4
5,4
5,4
5,3
Активность лизоцима,ЕД 2860+101
4450+129 5375+154 6750+145 7990+175 7950+195
Мощность облучения 0,500 MBT/ñì
Выход сухого в-ва, мг 5,0
5,5
5,2
5,5
5,4
Акт.ив ность лизоцима,ЕД. 3180+106
4700+183 5800+129 7290 193 8920 + 210 7800+170
Мощность облучения 0,750 .мВт/см
Выход сухого в-ва, мг
5,0
-5,7
5,3
5,4
5,4
Активность лиэоцима, ед 3260+123 4950+162 5300+175 6900р186 78501235 7408+180
1028ЗЗ4
Пример 6. Берут 6 групп клещей по 500 особей в группе. Клещи 1-й группы - контрольные. На кле щей 2-6-й групп воздействуют источником лазерного излучения мощностью . 0,500 мВт/см в течение 5 мин двукратно с интервалом между обработками 2 ч. Получение лизоцима осуществляют через 0,5 ч (2-я группа), 1,0 ч (з-я), 60 ч (4-я), - 120 ч (5-я), 150 ч (6-я) способом, описанным в примере 1.
В табл. 2 представлена зависимость активности и выхода сухого вещества лизоцима от времени, прошедшего после облучения клещей.
Т а блица 2
Время получения лизоцима иэ клещей, ч
Показатели
1.) 150
0,5
1,0
Предлагаемый способ
Предложенный способ
Активность лиэоцима, ЕД 3750+149 4903+175 10370+235 10570+297 . 8456+273
Выход сухоro в-ва, мг 5,2
5,6
5 2
5,5
5,4
Известный способ
Активность лизоцима,ЕД 2850+116
285$116 2930+150 3100+180 3150+185
Выход сухого в-ва, мг 5 0
5,0
5,0
5,0
5,0
Пример 7. Берут 8 групп кле- .4О щей по 500 особей в группе. Клещи
1-й группы (контрольные) обработке не.подвергают. На клещей 2-8-й групп воздействуют источником лазерного излучения с длиной волны 6328 А, мощностью 0,250 мВт/см2 в течение .5 мин. Клещей 2-й группы обрабатывают однократно, 3-й — двукратно.через 2 ч, 4-й — двукратно через 4 ч, 5-й-двукратно через 6 ч, 6-й — трехкратно через 2 ч, 7-й — трехкратно 50 через 4 ч и 8-й — iðåõêðàòío через
6 ч. Получение лиэоцима осуществляют через 60 ч после обработки способом, описанным в примере 1.
Пример 8. Берут 8 групп кле- 55 щей по 500 особей в каждой группе.
Клещи 1-й группы (контрольные) обработке.не подвергают. На клещей
2-8"й групп воздействуют источником лазерного излучения длиной волны
6328 А, мощностью 0,500 мВт/см в течение 5 мин. Клещей 2-й группы обрабатывают однократно, 3-й - двукратно через 2.ч, 4-й - двукратно через 4 ч, 5-й — двукратно через
6 ч, 6-й — трехкратно через 2 ч, 7-й группы трехкратно через 4 ч, 8
8-й — трехкратно через 6 ч. Получение лиэоцима осуществляют через
60 ч после обработки клещей способом, описанным в примере 1.
В табл.з представлейа зависимость активности и выхода сухого вещества от многократного облучения клещей.
1028334
Та блица 3
Мощность облучения, мВт/см показатели
0 25
0,500
Фиктивность лизоцима, ЕД, полученного при однократной обработке
5958+175. 4974+163 двукратной через 2 ч
6950+.145
6360+163
8550+277
4 ч
8180+203
7830+248
7950+233
6 ч трехкратной через 2 ч
8300+215
7550+203
9100+290
8876+285
Выход сухого вещества, мг, полученного при однократной обработке
5,3
5,2 двукратной
5,6 через 2 ч 5 4
5,4
5,6
5,5
5,3
6 ч трехкратной через 2 ч
5,3
5,4
5 2
4 ч
5 3
6 ч
5 1
П р и м е ч а н и е. Активность лизоцима и выход сухого вещества согласно известному; способу 2800ill0 ЕД-и 5 мг соответственно. тью в 1,5-2 раза большей, чем лизоцим, полученный по известному способу
ВНИИПИ Заказ 4839/5 Тираж 713 Подписное
Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4
Предложенный способ позволяет получить лизоцим из клещей активнос8700+217
8570+190
