Способ очистки протеолитического комплекса

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 9 76

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОВСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3774627/28-13 (22) 07.06.84 (46) 23,03.86. Бюл. Р 11 (71) Институт биохимии им.А.В.Палладина, Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии и Научнопроизводственное объединение

"Биохимреактив" (72) Н.Б.Аюшин, N.Â.Êoëoäsåéñêàÿ, С.А.Кудинов, Л.Б.Маленьких, В.Н.Акулин, Л.M.Эпштейн, А.К.Арен, P,Â.Берзиня-Берзите и И.К.Шпрунке (53) 577.15(088.8) (56) Feinstein G. Purification of

trypsin by аХйпйу, chromatography

on ovomucoid-sepharose resin. — Febs L etters 1970, 7, Ф 4, р. 353-355.

Robinson N.C., Туе R.W., Neurath Н., Walsh D.À. isolation of

trypsin by affinity Chromatography.—

Biochemistry., 1971, 10, Ф 14, р. 2743-2747.

ÄÄSUÄÄ 1219645 A (54) (57) СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИ ЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА из сырья животного происхождения, предусматривающий получение экстракта, сорбцию его на биоспецифическом сорбенте— овомукоид-сефароэе, промывку буфером и десорбцию целевого продукта при кислом значении рН, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, содержащего трипсин и химотрипсин с повышенной протеолитичес-1 кой активностью, и снижения себестоимости целевого продукта, в качестве сырья используют пилорические придатки лососевых рыб, сорбцию экстракта и промывку проводят 0,04-0,06 М фосфатным буфером рН 7,7-7,8, а десорбцию осуществляют 0,001-0,003 М раствором соляной кислоты, после чего рН целевого продукта до.водят до 7,6-7,8.

1219645

1с

24;

Изобретение относится к пищевой промышленности и-медицине, в частности к способам получения протеолитических ферментов, и может оыть использовано в биотехнологии, а rioлученный комплекс трипсина и химотрипсина — в пищевой промышленности, медицине, научных исследованиях.

Цель изобретения — повьппение активности целевого продукта, содержащего трипсин и химатрипсин с повышенной протеолотической активностью, и снижение себестоимости целевого продукта.

Сущность изобретения заключается в подборе более мягких условий выделения этих ферментов, используя фосфатный буфер низкой молярности для сорбции, а для десарбции целевого продукта слабую соляную кислоту с немедленным доведением рН элюата до 7,6-7,8. Раствор протеолитических ферментов, полученных из непищевых отходов — пилорических придатков лососевых рыб, наносят на колонку„ заполненную овомукоид-сефарозой.

Колонку выдерживают в перекрытом состоянии в течение 20-30 мин, затем асуп»ествляют промывку буфером для удаления несорбировавшегося материала и проводят десорбцию целевого продукта 0,001-0,003 М раствором соляной кислоты с последующим быстрым подщелачиванием элюата до рН 7,6-7,8 с помощью фосфатного буфера.

Пример 1. На колонку, заполненную 10 мл овомукоид-сефарозы

4В, наносят 80 мг пратеолитическага комплекса из пилорических придатков лососевых рыб, растворенного в 4 мл

0,04 M фосфатного буфера рН 7,8 при

4 С, с удельной активностью — трипсиновой 365 ед./мг белка (субстрат

БАМЭ вЂ” бензоил-аргинин метиловый эфир), химотрипсиновой — 343 ед./мг белка (субстрат АТМЭ вЂ” ацетил-тирозин метиловый эфир). Колонку выдерживают в перекрытом состоянии в течение

20 мин, после чего смывают несорбировавшийся материал 50 мл указанного буфера, а затем проводят десорб"цию целевого продукта с помощью

0,001 M соляной кислоты (скорость элюции 20 мл/u) с последующим быстВНИИПИ Заказ 1234/36

Филиал ППП Патент, г. рым (в течение 1-8 мин) подщелачиванием элюата. до рН 7,6 с помощью 1 М фосфатнога буфера. Удельная активность полученного препарата — трипсиновая

1000 ед. /мг белка, химотрипсиновая

2625 ед./мг белка.

Пример 2. На колонку, заполненную 12 мл овомукоид-сефарозы

4Б, наносят 100 мг протеолитического комплекса из пилорических придатков лососевых, растворенного в 5 мл

0,05 М фосфатного буфера рН 7,7 при

4 С, с удельной активностью — трипсиновой 380 ед./мг белка (субстрат

БАМЭ), химотрипсиновой 394 ед./мг белка (субстрат АТМЭ) . Колонку выдерживают в перекрытом состоянии в течение 30 мин, после чего проводят смывку балластного материала

60 мл укаэанного буфера. Десорбцию целевогo продукта осуществляют с помощью О,С02 М раствора соляной кислоты с последующим быстрым поцщелачиванием элюата да рН 7,7 с помощью 1 М Ьос@атного буфера рН 7,7. Удельная активность полученного препарата — трипсиновая

1100 ед./мг (субстрат БАМЭ), химотрипсиновая 2200 ед./мг белка.

Пример 3. На колонку, запал-teHHye 15 мл овамукоид-сефарозы

2Б, наносят 120 мг пратеолитического комплекса и пилорических придатков лососевых, растворенного в 4,2 мл

0,06 М фосфатного буфера рН 7,8 при о

5 С. Удельная активность исходного препарата -трипсиновая 429 ед./мг белка (субстрат БАМЭ), химотрипсинавая 443 ед./мг белка (субстрат

АТМЭ) .

Колонку промывают 70 мг указанного буфера, проводят десорбцию целевого продукта с помощью 0,003 M

НСЬ и быстро доводят рН элюата до

7,8 с помощью 1 М »Ьосфатнога буфера рН 7,,8. Удельная активность полученного пррдукта — 1рипсинавая

1000 ед./мг белка, химатрипсинавая

4000 ед./мг белка.

Таким образом, обеспечивается

° павьш ение активности целевого продукта по сравнению с исходной — по трипсину в 2,5-3 раза, по химотрипсину в 5-9 раз.

Тираж 490 Подписное

Ужгород, ул. Проектная, 4