Способ получения препаратов протеолитических ферментов

 

O H H C A Hi H E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союв Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заввлено 010977 (21) 2527203/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет—

Опубликовано 05,01.80.Бюллетень ¹ 1

Дата опубликовании описания 05.01.80 (51)М. Кл.

С 07 G 7/02//

61 К 37/48. Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (- З) УД (577. 15. 07 (088.8) (72) Авторы A.Ë.Êîìèññàðoâà Л.П.Раскина, N.Ì.Ôåëüäøòåéí, И О @т@НИй В.С.Якубович, В.К.Антонов, Л.H Бессмертная, Л.В.Козлов, К).И.Крылова и Н.Н.Молчанова

Всесоюзный научно-исследовательский институт

{71 ) ЗайВИтЕЛИ медицинских полимеров и Институт биоорганической химии АН СССР им. N.Ì.Øåìÿêèíà (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Известны различные способы получения ковалентных производных белков и ферментов, например, +-химотрипсина, с природными или-синтетическими полианионами, в частности — с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) . Получение таких производных достигается за счет образования ковалентной связи между аминогруппой белка и предварительно активированной карбоксильной группой полиэлектролита и, таким образом, делится на два этапа: активирование полиэлектролитной матрицы; П вЂ” образование ковалетной связи между ферментом и активированной матрицей ° Известные способы получения ковалетных производных ферментов с полисахаридными матрицами различаются по способу активирования матрицы. Среди наиболее распространменных способов получения водорастворимых ковалентных производных фер-

Настоящее изобретение относится к области химической энзимологии и может быть использовано для получения водорастворимых ковалентных производных протеолитических ферментов с полисахаридами для медицинских и биохимических целей.

2 ментов с кислыми полисахаридами следующие:

1) получение ковалентных производных путем взаимодействия белка с

5 азидом КМЦ, получающимся путем последовательной обработки метилового эфира КМЦ гидраэин-гидратом и нитритом натрия {1);

2) получение ковалетных производ)() ных путем взаимодействия белка с предварительно окисленной, действием хлорной кислоты КМЦ, сефароэой или сефадексом. B результате такого окисления глюкозидные кольца КМЦ пол)5 ностью или частично раскрываются с образованием альдегидных групп (2) и практически получается новый полимер с однозначно не идентифицированной первичной структурой, полностью

2() или частично утрачивающий свою полисахаридную природу.

Из двух перечисленных выме способов получения ковалентных производ-: ных лишь первый может рассматриваться как способ получения производных ферментов с полисахаридом, т.к.. в результате другого способа, как уже указывалось, полиэлектролитная матрица утрачивает свою полисахаридную

Зо природу.

707924

Наиболее близким к настоящему изоб- ретению является способ получения водорастворимого, модифицированного кислым полисахаридом препарата протеолитического фермента (ck -химотрипсина), описанный в работе (1). В качестве кислого полисахарида в известном способе используется КМЦ. Согласно известному способу получение модифицированного препарата осуществляется в два этапа и 5 стадий.

I этап — получение активированной формы (азида) КМЦ:

1) получение метилового эфира КМЦ путем обработки КМЦ метиловым спиртом в присутствии хлористого водорода;

2) получение гидразида КМЦ путем обработки метилового эфира КМЦ гидразин-гидратом;

3) получение азида КМЦ путем обработки гидразида KND, нитритом натрия.

1I - этап — получение ковалентного 20 производного d.-химотрипсина с KNU,:

4.) получение. ковалентного производного КМЦ с химотрипсиногеном путем обработки азида КМЦ химотрипсиногеном; 25

5) получение ковалентного производного c(. — химотрипсина КМЦ путем обработки ее химотрипсиногенового производного, не обнаруживающего ферментативной активности, трипсином. Стадии получения прои3водного с(.-химотрипсина с KNII, через химотрисиногеновое производное объясняется необходимостью избежать инактивации фермента в процессе реакции.

Однако этот способ имеет ряд существенных недостатков: а) многостадийность синтеза производного, значительно усложняющая его осуществление; б) возможность химической деструк- 40 ции полисахаридной матрицы при насыщении раствора КМЦ в метиловом спирте газообразным хлористым водородом (на стадии синтеза метилового эфира

КМЦ); 45

a) наличие двух фракций получаемого продукта — водорастворимой и водонерастворимой, и необходимость их разделения; г) необходимость очистки получае- 5О мого химотрипсинового производного

КМЦ от трипсина; д) ограниченность круга ферментов, ковалетные водорастворимые производ. ные которых могут быть получены этим способом без значительной их инактивации.

Целью описываемого способа является исключение многостадийности процесса, упрощение стадии очистки и расширение круга протеолитических фермен-60 тов, сохраняющих высокую активность в процессе получения модифицированных кислыми полисахаридами препаратов-. указанная цель достигается за счет того, что в качестве кислого полиса 65 харида используют альгиновую кислоту, водный раствор соли любого одновалентного катиона которой подкисляют до достижения рН 1,0 + 1,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферном растворе фермента.

Смысл описанной процедуры заключается в том, что при подкислении раствора альгиновой кислоты происходит ее частичная ангидридизация. Мое дификация фермента кислым полисахаридом происходит за счет взаимодействия нуклеофильных групп фермента на поверхности белка с ангидридныМИ группами кислого полисахарида.

Согласно изобретению описывается упрощенный способ получения водорастворимых препаратов модифицированных кислыми полисахаридами протеолитических ферментов, в котором в качестве кислого полисахарида используют альгиновую кислоту, водный раствор соли которой подкисляют до достижения рН 1,0 — 1,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферНоМ растворе фермента.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом: к 0,5Ъ раствору альгината натрия добавляют концентрированную соляную кислоту до достижения рН 1,0. Осадок отделяют центрифугированием либо фильтрованием, промывают водой до рН 3,0 и лиофильно высушивают. Одну весовую часть ангидридизованной альгиновой кислоты растворяют при перемешивании в охлажденном до 4 С 0,2 M растворе фосфатного буфера, рН 7,5, содержащем одну весовую часть протеолитического фермента. Продолжают перемешивание раствора при 4 С в течение 24 ч. Далее раствор подкисляют до рН 2,0 и модифицированный препарат фермента отделяют центрифугированием или фильтрованием. Продукт очищают от непрореагировавшего фермента много-3 кратной промывкой препарата 10 н. раствора соляной кислоты и 2 M раствором хлористого натрия в 10 н.растворе соляной кислоты попеременно. Очищенный продукт растворяют в воде и лиофильно высушивают.

Пример 1. Получение производных сС -химотрипсина с альгиновой кислотой.

Стадия 1. Получение альгиновой кислоты в ангидридизованной форме.

K 0,5% раствору альгината натрия добавляют концентрированную соляную кислоту до достижения рН раствора, равного единице. Образующийся осадок отделяют центрифугированием либо фильтрованием, промывают дистиллированной водой до рН 3 и лиофильно высушивают. Определение концентрации ангидридных групп в полученном продукте проводят по методу Меншуткина.

707924

Формула изобретения

Составитель A.Áo÷apoâ

Техред Э.Чужкк

Корректор N.Пожо

Редактор Н.Хайтовская

Подписное

Заказ 8430/21 Тираж .495

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений к открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Для этого 0,1 r полученной ангидридизованной кислоты вносят в 10 мл

1%. раствора мета-нитроанилина в спирте и добавляют 10 мл воды. После выдерживания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте оставшиеся свободными кар5 карбоксильные группы титруют 0,1 М раствором гидроокиси бария с индикатором фенолфталеином. Содержание ангидридных групп рассчитывают по результатам титрования, исходя из того, что при обработке мета-нитроанилином половина всех ангидридизованных карбоксильных групп превращается в анилид. Определенное таким образом количество карбоксильных 15 групп альгиновой кислоты, включенный в ангидридные связи, составляет около 30%.

Стадия 2. Получение ковалентных производных d.-хипотрипсина с альги- gQ новой кислотой„

1 F ангидридизованной альгиновой кислоты, полученной на стадии 1, как описано выше, растворяют при перемешивании в охлажденном до 4 С 0,2 М раствора фосфатного буфера рН 7,5, содержащем 1 r К-химотрипсина. После 24 ч перемешивания реакционной смеси при температуре 4 С получившееся ковалетное производное о -хкмотрипсина с альгиновой кислотой после подкисления раствора до рН 2,0 выделяют центрифугированием или фильтрованием. Продукт очищают от непрореагировавшего с(.-химотрипсина многократной промывкой раствором соляной

-3 кислоты 1:10 н, и 2N раствором хлористого натрия в 1 ° 10 М растворе соляной кислоты попеременно до полного отсутствия белка в надосадочной . жидкости, регистрируемого спектро- 40 фотометрическк при 280 нм. Очищенный продукт после заключительного промывания 1"10 М раствором соляной кислоты растворяют в дистиллированной воде к лиофильно высушивают. 45

Содержание белка в полученном продукте, определенное спектрофотометрически, а также по элементному и аминокислотному анализу, составляет

240-258 мг/г препарата. Ферментная активность полученного продукта, определенная по стандартному субстрату вЂ,этиловому эфиру N-ацетилтирозина (АТЭЭ) составляет 66-70 мг активного фермента на 1 r препарата Продукт 55 хорошо растворим в воде.

Пример 2. Получение производных пепсина с альгиновой кислотой.

0,1 г ангидридизованной кислоты, полученной на стадии 1 примера 1, растворяют при перемешиваник в охлажденном до 4 С 0,1 М ацетатном буфере рН

4,8, содержащем 0,1 г пепсина. Получение и выделение ковалентного производного пепсина с альгиновой кислотой ведется как в примере 1.

Содержанке белка в полученном препарате — 112 мг/г.

Протеолитическая активность по гемоглобину — 22000 пепсиновых единиц.

Препарат- имеет высокую водорастворимость.

Пример 3. Получение производных трипсина с альгиновой кислотой.

По методике, описанной в примере

1, получают ковалентное производное трипсина с альгиновой кислотой, взяв вместо — химотрипсина такое же,количество трипсина. Ферментная активность полученного препарата, определенная по стандартному субстрату зтиловому эфиру И-ацетилбензоиларгинина — составляет 60-65 мг/г препа-рата. Количество связанного белка составляет 220 мг/г препарата. Продукт легко растворим в воде.

Способ получения препаратов протеолитических ферментов путем обработки их кислыми полисахаридами, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения круга. ферментов, сохраняющих высокую активность, в качестве кисло-о полисахарида используют альгиновую кислоту, водный раствор соли юпобого одновалентного .катиона, которой подкисляют до достижения рН 1,0-1,5, а образовавшийся осадок растворяют в буферном растворе фермента.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Patat F.,Hirsch Н. "Nodifi- .

kationen und MolekuIargewichtsVergroberungen ат са.-Chymotrypsin"

Е.Naturforschung, 216, 36-42, 1966 (прототип) .

2. Торчилин В Л ., Рейвер И.Л.-,Смирнов В.Н.,Чазов Е.И.,Иммобилкзация ферментов На бкосовместимых носителях.

Ll.Иммобилизация . -химотрипсина на растворимых декстранах. Биоорганкчес кая химия,т.2, Р 9„ с.l?52, 1976„