5-(n @ -сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)- аминонафталин-i-(n-пропил) сульфамид в качестве анса- субстрата для определения химотрипсина и 5-(n @ - бензилоксикарбонил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)- аминонафталин-i-(n-пропил)сульфамид в качестве полупродукта для его получения

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОП КСАН И Е И ЗС) ВРЕТЕ Н

К ПАТЕНТУ

$01!4НС,Н, R = Suc (1a

R = Suc (1б) ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

HPÈ ГКНТ СССР (21) 4872552/04 (22) 20.07.90 (46) 23. l0.92. Бюл. N 39 (71) Институт биохимии Литовской АН и Институт молекулярной генетики АН СССР (72) P.À.ßí÷eíå. А,И.Палайма, А.А,Недоспасов и Р.И,Матуляускене (73) Институт биохимии Литовской АН (56) Methods in Enzymology чо!. 80, Proteolytic

Enzymes, Part. С, N — J. London, 1981, ed, by

L.Loramt, R. Lottenberg u gp, "Assay of coagulation Proteases using Peptide Chromogenle

and Flurogenie Substrates", раде 341 — 361.

Недоспасов А.А., Незавибатько В,Н. и др. "Возможный подход к анализу смесей протеаз" известия АН СССР серия биологич„1989, т..15, ¹ 1, с. 128. (54) 5-(й, ;CY КЦИ Н ИЛ-АЛАН ИЛ-АЛАНИЛПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНОНАФТАЛИН-1-(N-ПРОПИЛ)СУЛ6ФАМИД В КАЧЕСТВЕ АНСА-СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИМОТРИПСИ НА И 5-(N

-БЕ НЗИЛОКСИКАРБОНИЛ-АЛАНИЛ-АЛАНИЛ-ПРОЛИЛ-ФЕНИЛАЛАНИЛ)-АМИНОНАФТАЛ И Н-1-(N-П РОГ1ИЛ) СУЛ Ь ФАМ ИД 8

КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТА ДЛЯ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно 5-(N -сукцинил-А!а-Ala-Pro-Phe)-аминонафталин-1-(Nпропил)сульфамиду формулы !а:

М "Ala"А!а-РгG-Pha-Н)! (19) (11) (s1)s С 07 К 5/10, С 12 N 9/7G (57) Использование: в медицинской и биологической химии как АНСА-субстрат для определения химотрипсина. Сущность изобретения: 5-(N*-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин

-1 (N-пропил)сульфамид формулы la:

Х-A(G-Ata-Р О-РЬ -HN-C CH-C- CH=CH

«Н=С-С-СН=С$0114НСЗН У

x=Suc и 5-(N -бензилоксикарбонил-аланил-аланили ролил-фен ил алан ил)-амин о нафталин-1-(И

-пропил)сульфамид, !б, (Х = Z), в качестве подупродукта для получения Ia. Реагент 1: (N -бенэилоксикарбонил аланил-аланилпропил-фенилаланил)аминонафталин-1

-(N-пропил)сульфамид, пзлученный путем. взаимодействия N -бензилоксикарбонил фенилаланина с 5-аминонафталин-1-(Nпропил)сульфамидом, деблокированием полученного продукта, постепенным наращиванием пептидной цепи до соединения б и деблокированием последнего. Реагент

2: ангидрид янтарной кислоты. Процесс ведут в смеси ТГФ и ДМФА при 80 С, la, 587, СзтН4тйв509 (а) ) = -18,0 (0,5 (, ДМФА). !б

С41Н49йвЯОв (а)У вЂ” 12,47 (1 )(, ДМФА). в качестве субстрата для определения химотрипсина и 5-(й.ь-бенэилоксикарбонилAIa-А!а-Pro-Phe)-аминонафталин-1-(N-про пил)сульфамиду формулы !б в качестве полупродукта для получения la, которые могут найти применение в медицинской и биологической химии.

Известен ряд синтетических хромогенных субстратов для определения химотрип1771478 ферментов методом AHCA-анализа. 40

Поставленная цель достигается новым . использованием нового 5-(N<-бензилокси- 45

55 сина на основе п-нитроанилина, 2-нафтиламина, и-метохси-2-нафталамина и др, Эти субстраты обычно успешно используют для определения только одного фермента в исследуемой про.бе (1).

Описываемое соединение используется в АНСА-анализе.

АНСА-анализ — новый метод анализа смесей и ротеаз, в том числе как близкой так и различной специфичности. Идея метода состоит в использовании s одном анализе смеси нескольких субстратов, с определением продуктов протеолиза каждого из них.

Для реализации метода в варианте с применением хромотографии предложены хромогенные субстраты с аминонафталинсульфамидными детектируемыми группами. Найболее близкими по структуре являются пептидильные производные 5аминонафталин-1-сульфамидов (2). Например, 5-тозилглицил-пролил-аргиниламин о нафтал ин-1-{Й-пента метил е н)сул ь фа мид для АНСА-анализа трипсина, Однако трипсин и химотрипсин, являющиеся сериновыми протеазами, различаются еубстратной специфичностью, Указанный пептидильный производный Тоэ-Gly-ProArg-АНСА, как и другие известные АНСАсубстраты практически не расщепляются химотрипсином. Поэтому они не могут быть использованы в качестве АНСА-субстрата при определении химтрипсина.

Целью изобретения является поиск в ряду замещенных пептидильных производных аминонафталинсульфамидов новых соединений, позволяющих при использовании их в качестве детектируемых групп для

АНСА-анализа определить химотрипсин, т.е. увеличить количество анализируемых

5-(N -сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-амин онафталин-1-(N-пропил) сульфамидом в качестве АНСЛ-субстрата и карбонил-аланил-аланил-пролил-фенилала н ил)-а ми н о нафталин-1-(N-и роп ил)сул ьфамида в качестве полупродукта для его получения.

Изобретение иллюстрируется примерами (схема синтеза прилагается).

Пример 1. 5-(Бензилоксикарбонилфенилаланил)аминонафталин-1-(N-пропил) сульфамид (а). К раствору 2,99 г (0,01 моль) (N -бензилоксикарбонилфенилаланина и 1,4 мл (0,01 моль) триэтиламина в 50 мл абс. тетрагидрофурана (ТГcD) медленно добавляют 1,37 r (0,01 моль) хлорангидрида изобутилового эфира муравьиной кислоты при перемешивании при -18 С. Реакционную

35 смесь выдерживают 15 мин. при этой температуре, образуется осадок хлоргидрида триэтиламина, после чего добавляют раствор

2,64 г (0,01 моль) 5-аминонафталин-1-(Nпропил)сульфамида в 20 мл абс. ТГФ. выдерживают 1 ч при -18 С и 2 ч при 20 С.

Осадок отфильтровывают, растворитель упаривают досуха, осадок растворяют в этилацетате, промывают 1 н, раствором HCI. 5 раствором КаНС03 и водой, сушат и упаривают досуха. Полученный продукт три раза промывают кипящим эфиром и отфильтровывают, Получают 3,54 г (выход

65 ) соединения (а) (Z-Phe-AH CA-Pr) с т. пл.

196-197 С, Rg = 0,72 (СНС!3-этилацетат-метанол в соотношении t4:7:1 соответственно).

Найдено, : С 664 Н 57 S57 N 78

СЗОНЗ1И305$.

Вычислено, о: 66.0 5,7 5,9 7,7:

Спектр ПМР (д, м.д„растворитель

ДМСО-бе): 0,64 (СН3, т,. ЗН), 1,22 (СН2. С!К., 2Н), 2,69 (КСН2, 2Н), 3.02 (CH2Ph- 2Н), 4,59 (СН, 1Н), 5,02 (СН2, с, 2Н), 7,2-8,5 (Ap и NH, 17Н), 10,1 (NH, 1Н).

Пример 2. 5-(Фенилаланил)аминонафталин-1-(N-пропил)сульфамида гидробромид (б), 3,5 г (6,4 моль) соединения (а) (Z-Phe-АНСА-Рг) растворяют в 30 мл 3 н. раствора Har в уксусной кислоте и перемешивают на магнитной мешалке в течение 2 ч. Реакционную смесь разбавляют абс. эфиром и отфильтровывают выпавший осадок, который на фильтре несколько раз промывают эфиром. Получают 2,85 г (выход 90 ) продукта (б) (Рпе-АНСА-Pr H Br) с т, пл. 220222 С, Rr = 0,67 (бутанол-уксусная кислотавода в соотношении 4;1:2), (п)0 =- 24.7 (1 диметилформамид) (ДМЕ).

Найдено, : С 54,0 Н 5,3 N 8,4 $6 2 Вг

15,9.

С22 H26N3O3S В r.

Вычислено: 53.7 5;3 8,5 6,5 16,2.

Спектр ПМР(д, м,д., растворитель

ДМСО dg): 0.64 (СН3, т. ЗН), 1,24 (CH2, секс..

2Н), 2,31 (NCH2, 2H), 3,2 (СН2Рй, 2Н), 4,47 (СН, 1Н), 7,32 (Ар, 5Н), 7,32-8,17 (Ар и NH.

7Н), 8,44 (NH2. 2Н), 10,48 (NH, 1Н).

Пример. 3. 5-(N -t-бутилоксикарбонил-пропил-фенилаланил)-аминонафталин1-(N-пропил)сульфамид (в), 1.53 г (7,1 ммоль)

N -t-бутилоксикарбонил-пролина и 0,99 мл (7,1 ммоль) триэтиламина растворяют в

30 мл абс. ТГФ., охладжают до -20 С, добавляют при перемешивании 0,68 мл (7.1 ммоль) этилхлорформиата и выдерживают при20 С 20 мин. К полученному смешанному . ангидриду прибавляют предварительно подготовленный (охлажденный и отфильт1771478 рованный) раствор 3,5 г (7.1 ммоль)соединения (б) и 0.99 мл (7,1 ммоль) триэтиламина в 40 мл абс. ТГФ. Реакционную массу перемешивают при температуре -20 С 1 ч и 1 ч при комнатной температуре. Реакционный 5 раствор фильтруют, упаривают досуха, остаток растворяют в этилацетате, промывают последовательно 1 н. раствором HCI,5% раствором ИаНСОз и насыщенным раствором NaCI. сушат, упарива.от, заливают абс. 10 эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают. Получают 2,15 г(выход 50 /) соединения (в) с т. пл. 126-130 С, Rt = 0,35 (хлороформэтилацетат-метанол в соотношении 14:7:1), (c)if= -26,18 (1 /, ДМ F).

Найдено, : С 63,2 Н 6,5 S5,,2 N 8,9.

С32H4pN40gS.

Вычислено, : 63,1 6,6 5,3 9,2.

Спектр ПМР (д, м.д., растворитель

ДМСО <16): 0.62 (СНз, т, ЗН), 1,16 (СНз, с, и

4CHz, NH), l.64 (2CHz, 4Н), 2,68 (СН2М, кв., 2Н). 3,1 (CH2Ph, 2Н), 3,28 (CHz, 2Н), 4,07 (СН, 1Н). 4.82 (СН, 1Н), 7,24 (Ар, 6Н), 8;49 (К Н, g, 1Н). 10.2 (NH. с. 1Н).

Пример 4. 5-(Пропил-фенилаланил)аминонафталин-1-(N-пропил)супьфами да гидрохлорид (г). 1.3 г (2 ммоль) соединения (в) растворяют в 15 мл 3 н. раствора HCI в уксусной кислоте и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь разбавляют абс. эфиром и отфил ьтровы вают вы павший осадок, который на фильтре промывают све-. жим эфиром. Получают 1,09 г (выход количественныйй) хроматографически однородного вещества, R< = 0,4 (бутанол-уксусная кисло35 та-вода в соотношении 4:1:2).

Пример 5. и -Бензилоксикарбонилаланил-аланин (д). Раствор 10 г (62 ммоль) аланил-аланина и 11.6 г (109 ммоль) Ма2СОз в 75 мл воды охлаждают до 0 С и при энергичном перемешивании добавляют 13,64 г (80 ммоль) карбобензоксихлорида. Реакционная смесь в течение всего времени дол>кна оставаться слабощелочной. После

4-часовой выдержки раствор осторожно подкисляют до рН 2 конц. HCI. Осадок отфильтровывают, высушивают, растворяют в этилацетате, промывают 1 í, расТВороМ

HCl. водой и экстрагируют раствором

NazCQa. Экстракт подкисляют конц. HCI, 50 выпавший осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 11,6 r (выход 68 /О) соединения (д) с т. пл. 147-148 С, Rt = 0,47 (СНС!з-этилацетат-метанол в соотношении

14;7:1), (и)6 =- -1.8 (1 % ДМР). о

Спектр ПМР (д, м.д., растворитель

ДМСО dr); 1,37 (СНз, 2g, 6Н), 4,27 (две СН, 2Н). 5,17 (CHz. с. 2Н), 7.47 (Ар. с. 5Н), 8,22 (NH 2Н) Пример б. 5-(N -Бензилоксикарбонил-алан ил-алани п-пролил-фен илаланип

)ами- нонафталин-1-(N-пропил)сульфамид (! 6), 0,65 г (2,2 ммоль) соединения (д) растворяют в 15 мл абс, ДМР, охлаждают до -10 С. добавляют последовательно при перемешивании 0,31 г (2,4 ммоль) оксибензтриазола, 0,59 г (2,4 ммоль) N,N -дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и выдерживают при -10 С

30 мин. Затем к реакционной смеси прибавляют предварительно охла>кденный раствор

1,21 г (2,2 ммоль) соединения (в) в 10 мл а6с.

ДМР. Реакционную массу перемешивают

30 мин., добавляют 0,3 мл (2,2 ммопь) триэтиламина и оставляют на 24 ч. Смесь отфильтровывают, выливают в 0,5 л Н20, продукт экстрагируют этилацетатом, экстракт промывают раствором и 5 / КаНСОз, н. HCI и насыщенным раствором NaCI, высушивают над MgS04 упаривают. заливают абс. эфиром. Выпавший осадок отфильтровывают. Получают 0,78 r (выход

43 >) соединения (1б). Вт = 0,47 (хлороформэтилацетат-метанол в соотношении 14:7;1), (а}о = -12,47 (1 %, ДМ Е).

Найдено,,; С 62,26 Н 6,49 S 3,81, С41Н49йвЯО8.

Вычислено, /: 62,55 6,28 4,07.

Спектр ПМР (д, м.д., растворитель

ДМСО

Пример 7, 5-(Аланил-аланил-пропилфенилаланил)аминонафталин-1-(Л -пропил) сульфамида гидробромид (е). 7,2 г (8,7 ммоль) соединения (! 6) (Е-Ala-Ala-Pro-Phe-AH CA) заливают 90 мл 3 н. раствора HBr в СНзСООН и перемешивают 1 час при комнатной температуре. Затем прибавляют 400 мп абс. эфира, продукт выпадает после охлаждения. Осадок быстро отфильтровывают, промывают несколько раз эфиром и высушивают над P20g в вакууме. Получают 5,4 r (выход 82 /) хроматографически однородного вещества (е) s виде мелкокристаплического порошка, R< = 0,69 (бутанол-уксусная кислота-HzO в соотношении 4:1:2).

Пример 8. 5-(К,<;Сукцинил-аланилаланил-пролил-фенилаланил)а линонафталин-1-(N-пропил)сульфамид (la). 3,5 г (4,8 ммоль) соединения (е) (А!а-А!а-Pro-PheAHCA-Pr HBr) растворяют в смеси 100 мл абс. ТГФ и 5 мл абс. ДМЕ, прибавляют 0,48 г(4,8 ммоль) ангидрида янтарной кислоты, нагревают при 80 С 2 ч., раствор охлаждают

1771478 бл Аla A(a-Pro Pho HN ггу о зо,ни с,н, Z AIC-Ala-pr0-Phe-НН фго) и кНС Нв

Составитель Р. Янчене

Техред M.Моргентал Корректор А. Мотыль

Редактор

Заказ 3754 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r, Ужгород, ул.Гагарина, 101 и прибавляют 350 мл абс. эфира. Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают и сушат под Р205. Получают.2,1 г(выход 58 %) (la) (Suc Ala-Ala-Pro-Phe-AHCA-Рг); Rg = 0,78 (бутанол-уксусная кислота-Н20 в соотношении 4:1.2), (а) =-18,0(0,5 % ДМЕ).

Найдено, %: С 56,37 H 6,69 $4,39.

Сз7Н47йв$09 2HzO.

Вычислено, %: 56,40 6,52 4,07, Спектр ПМР (д, м.д., растворитель

ДМСО бе): 0,69 (СНз, т, ЗН), 0,93-1,42 (две

СНз и три СН2, 12Н), 2,44 (OCCH2CHzCO, перекрываются с сигналом растворителя), 2,62-3,23 (СН2, 6Н), 4,23 (СН, ЗН), 4,78 (СН, 1Н), 7,07-8,14 (Ар и NH, 14Н), 8,51 (ИН, g, 1Н), 9,9 (NH, с, 1Н).

Пример 9. Анализ химотрипсина и трипсина. К 0,35 мл субстратной смеси, содержащей по 3,5 О.Е. (it = 300 нм)/мл 5(й, .-тозил-глицил-пролил-аргин ил)а ми нонафталин-1-(N-бутил)сульфамида (субстрат трипсина р тромбина) и Suc-Ala-Ala-ProPhe-АЙСА (la, субстрат химотрипсина), 0,1 .

О,Е. (А =340 нм)/мл дансилвалина (внутренний стандарт) в 0,05 M трис-HCI буфера рН

7,4 добавляют 10 мкл водного раствора одного или другого фермента (фермент разводят до концентрации, обеспечивающей гидропиа 1 g субстрата в 1 мин, перемешивают, инициируют 2 мин п ри 37 С. добавляют СНзСООН до рН 4,3, перемешивают, .добавляют 0,5 мл смеси этилацетат, гексан (2: l), перемешивают верхний слой отделяют, высушивают досуха. Остаток растворяют в 0,05 моль ацетата аммония в 35%-ном ацетонитриле, хроматографируют на колонке Zorbax С-18 (4,6 250 мм) при 40 С и скорости потока 1 мл/мин и определяют АНСА додетекции по поглощению при А =-254 нм.

При использовании тромбина и трипсина на хроматограмме присутствует только пик

5-ам и но на фтал и н-1-(N-бутил)сул ьфа мида (> 99 %, время удержания 10,60 мин), при

5 использовании химотрипсина — только пик

5-аминонафталин-1-(N-пролил)сул ьфамида (> 99 Я„время удержания 6,65 мин).

Таким образом использование предложенного соединения la в качестве субстрата

10 позволяет качественно определить химотрипсин и увеличить количество анализируемых ферментов при АНСА-анализе, а использование соединения 1б в качестве полупродукта — получить необходимый целе15 вой продукт1ат

Формула изобретения

1. 5-(Q-сукцинил-аланил-аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафталин-1-(М-пр

20 опил)сульфамид формулы la в качестве AHCA-субстрата для определения химотрипсина

2. 5-(N-бензилоксикарбонил-аланил30 аланил-пролил-фенилаланил)-аминонафта лин-1-(N-и ропил)-сульфамид формулы 1б в качестве полупродукта для получения АНСА-субстрата химотрипсина формулы (а.