Способ определения протеолитической активности желудочного сока

 

Изобретение относится к медицине . Цель изобретения - повышение точности способа, В желудочном соке контролируют ферментативную активность пепсина в реакции гидролиза гемоглобина, Желудочньй сок инкубируют с пепсином, иммобилизованным на силохроме. Промывают О,1 М триобуфером. Элюируют силохром I М раст-. вором NaCl. Повторно определяют протеолитическую активность желудочного сока с помощью гемоглобина в присутствии полученного элюата. По снижению активности в сравнении с исходной определяют ингибирующую активность желудочного сока. 1 ил, 2 табл. ю со ф СП со 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5D 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (.21.) 3673833/28-14 (22) 19.12.83 (46) 23.06.86.- Бюл. 9 23 (72) Е.И.Ткаченко, Н,М.Лещенко, И.В.Москвичева и В.П.Ткаченко (53) 616.07(088.8) (56) Локшина Л.А. Структура и активность протейнкиназ желудочно-кишечного тракта, Исследования системы . пепсиноген-пепсан. Автореф. докт. дисс. М. МГУ, 1967. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА . (57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения — повышение

„„SU„„1239593 А 1 точности способа. В желудочном соке контролируют ферментативную активность пепсина в реакции гидролиза гемоглобина. Желудочный сок инкубируют с пепсином, иммобилизованным на силохроме. Промывают 0,1 М трисбуфером. Элюируют силохром М раст-. вором NaC1. Повторно опредепяют протеолитическую активность желудочного сока с помощью гемоглобина в присутствии полученного элюата, По снижению активности в сравнении с исходной определяют ингибирующую активность желудочного сока, 1 ил, 2 табл.

t 12

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при исследовании заболеваний желудка.

Целью изобретения является повышение точности способа при опреде-. лении ингибирующей активности, На чертеже представлен график для определения концентрации пепсина.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут желудочный сок, контролируют ферментативную активность пепсина в реакции -гидролиэа гемоглобина; иэ анализируемой пробы выделяют ингибитор протеолиза обработ" кой желудочного сока иммобилизованным пепсином, освобождают ингибитор из образовавшегося комплекса солюбилизацией, реакцию гидролиэа гемоглобина пепсином проводят в парал.— лельных пробах в,присутствии вьщеленного ингибитора и без него, а по разности активностей пепсина в данных пробах судят с торможении.

Для проведения операций градуироиания, определения концентрации протеолитического фермента и активности ингибитора в качестве эталона ис.пользуют обычный кристаллический пепсин, а операцию вьщеления ингибитора осуществляют с применением иммо- билизованного пепсина, на силохроме через посредник-поливинилпирролидонакролеин (для сохранения нативной структуры фермента, что важно для полного проявления его сродства к выделяемому ингибитору) .

Носитель иммобилизованного пепсина (силохром) имеет крупные размеры. частиц, Это ускоряет процесс выделения ингибитора.

Для предотвращения ферментативного гидролиэа белков и соосаждения сопутствующих продуктов ферментативного распада выделение ингибитора протеолиза осуществляют на холоду при 2-5 °

Пример. У шести пациентов с помощью тонкого зонда осуществляют забор желудочного сока в течение часа. Из каждой полученной порции сока берут по 25 мл выделения ингибитора пепсина, а остальной используют в лаборатории для определения рН, протеолитической активности и др.

Активность пепсина определяют по скорости расщепления им кристалли39593 2 ческого гемоглобина по общепринятому методу Ансона. Для этой цели составляют инкубационную смесь следующегo состава: 0,2 мл 0,2 М фосфатный буфер, 0,1 мл 27-ного раствора гомоглобина в 0,12 M HC),0,1 мл водного раствора кристаллического пепсина в концентрации 5-30 мкг/мл, В контрольную пробу, против которой производят измерения опытных образцов, вместо фермента вносят

0,1 мл дистиллированной воды, Смесь инкубируют 20 мин при 37 С. Затем в каждую пробирку вносят по 5 мл 57-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), инкубируют 2 мин при 37 С и фильтруют через бумажные фильтры. В полученных фильтратах определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 280 нм в 1, см кюветы при комнатной температуре. Значение оптической плотности фильтратов являются показателем активности фермен" та в описанных условиях проведения реакции протеолиза. Зависимость ак- тивности пепсина от его концентрации представленн в табл, l..

Таблица

Концентрация пепси- на, мкг/мл

Оптическая плотность ОП фильтрата, ед, ОП при

280 нм

30 Количество проведенных опытов

5 5 О., 100

0,130

0,290

40

0,293

25

0,375

5 30 0,450

Для построения графика зависимости активности пепсина от его концентрации 30 мг кристаллического nenS0 сина марки ХЧ растворяют в дистиллированной воде и объем раствора доводят до 100 мл. Из полученного раствора с точной концентрацией фермента (300 мкг/мл) готовят ряд раз- ведений, как указано в табл, 1, ставят реакцию и определяют оптическую плотность фильтрата. Показатели оптической плотности фильтрата, l 239593

Пациент

0,320+0,0!2

194,5+25,3

Г-в

Г-в

0,307+0,022

154,2+9,8

Т-о

К-о. 148,0+25,3

И-в 0,296+0,025

0,270+0,034

138,7+14,8

П-в

3 представленные в табл. 1, являются средними величинами иэ 5 опытов, На основании полученных результатов строят график зависимости активности пепсина от его концентра- ции (фиг. 1), с помощью которого по протеолитической активности желудочного сока определяют содержание в нем пепсина.

Для определения содержания,пеп10 сина в пробах желудочного сока составляют реакционную. смесь как при определении активности пепсина, . но вместо 0 1 мл фермента, вносят в нее 0,1 мл желудочного сока и проводят реакцию гидролиза гемоглобина как прн определении активности пепсина, По полученным величинам оптической плотности фильтратов с помощью графика зависимости активности пепсина от его концентрации (фиг.l) определяют концентрацию фермента в анализируемых пробах. Полученные в работе значения содержания пепсина в желудочном соке шести пациентов представлены в табл. 2, Далее выделяют ингибитор протеолитических ферментов из желудочного сока. В 6 пробирок, содержащих по

25 мл охлажденного в ледяной бане до 2+5 С желудочного сока пациен» тов, прибавляют по 25 мл суспенэии пепсина, иммобилиэованного на силохроме через посредник — поливинилпирролидонакролеин, и инкубируют в 35. течение часа, периодически перемешивая, Дальнейшая работа также ведется на холоду — в ледяной бане при

2+5 С и предварительно охлажденной центрифуге до той же температуры. 40

Образовавшийся комплекс пепсин— ингибитор осаждают центрифугированием в течение 10 мин. Осадок промывают от неспецифическн сорбировав. шихся компонентов О,! М трис — HCl ..45 буфером рН 7,0 и вновь осаждают центрифугированием в тех же условиях.

Для диссоциации полученного комплекса солюбилиэации выделяемого пепсина

его обрабатывают 25 мл трис-HCl 50 буфера рН 7,0, содержащего 1,0 М хлористый натрий в течение 30 мин (для полноты диссоциации) и разделяют центрифугированием в указанном ранее режиме. Полученные таким образом су- 55 пернатанты содержат ингибитор протеолитических ферментов, выделенный из желудочного сока пациентов.

Определение активности ингибитора проводят пятикратно для каждого пациента. Для этого в 36 пробирок (6 пациентов по 5 проб — 30 пробирок, 5 пробирок для определения активности пепсина без ингибитора, и

1 пробирка — контроль, против которой измеряют остальные пробы вносят инкубационную смесь. В 30 пробирок добавляют по 0,1 мл ингибитора, выделенного иэ желудочного сока пациентов, а в 5 пробирок по 0,1 мл буфера, использовавшегося для солюбили-. зации ингибиторов (в этих пробах определяют активность кристаллического пепсина, а в предыдущих 30 пробирках — влияние на эту реакцию .ингибитора). Все пробы .инкубируют

20 мин при 37 С, обрабатывают ТХУ, фильтруют, определяют оптическую плотность раствора и по графику (фиг. 1) находят концентрацию пепсина в анализируемых пробах.

Активность ингибитора определяют по разнице активностей фермента в пробах без ингибитора и в пробах с внесенным ингибитором.

Протеолитическая активность желудочного сока и активность ингибитора пепсина, вьщеленного из желудочного сока тех же пациентов представлена в табл. 2. .:Т абли ца

Концентрация Активность пепсина в жел. ингибитора соке, мг/мл пепсина, мкг/мл, мин

0,286+0,018,: 129)4+18,2

0,221+0,016 113,9+11,4

При клинических исследованиях желудочного сока. пациентов о содержании в нем пепсина судят по протеолитической активности желудочного сока. Однако истинное содержание пепсина может быть скрыто наличием в исследуемой смеси ингибиторов протеолитической активности, содержа1239593

Формула и з о б р е т е н н я

Способ определения протеолнтической активности желудочного сока путем взаимодействйя его с гемоглобиО,У

5 ю а го gs зо

Палсин мкг/мл

Составитель М.Позняк

Техред Н.Бонкало

Корректор E..Ðîøêî, Редактор В.Иванова

Заказ 3389/43 Тираж 778 : . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ние которых также должно зависеть. от физиологического состояния пациента и влияния различных факторов.

В способе. выделяют вещества, обладающие сродством к пепсину, что присуще, главным образом, ингнбиторам данной реакции.

Способ учитывает влияние ингибиторов протеолиза и повышает тем самым надежность процедуры обследования больных. ао, В ЦЗ

Фй

3i е6 И

0 ном с последующей фотометрией продуктов гидролиэа, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повы5 шения точности способа при определении ингибирующей активности, желудочный сок дополнительно инкубируют с.пепсином, иммобилизованным на силохроме, промывают 0 1 М трис-буфер1п ным раствором, элюируют силохром

1 М раствором NaCi, далее цовторно определяют протеолитическую актив" ность желудочного сока с помощью

"гемоглобина в присутствии полученного элюата и по снижению активности в"сравнении с исходной определяют ингибирующую активность желудочного сока.