Способ выделения миозина из мышечной ткани сердца

 

Изобретение относится к биохимии и иммунологии. Цель изобретеа 1973, хиния - упрощение способа, повышение активности и выхода целевого продукта . Мышечную ткань сердца гомогенизируют 4 раза по 10 с при 25000- 26000 об/мин в буфере. Затем центрифугируют при 22000 g в течение 20 мин. Актин удаляют из раствора с концентрацией белка 4-6 мг/мл центрифугированием при 180000- 200000 g в течение 1,5 ч. Миозин осаждают при рН 5,6-5,7. Фракцию продукта при насьпцении 42,5% сульфатом аммония диализуют и центрифугируют. Нижний слой супернатанта используют в качестве собственно препарата миозина . 4 табл. Q IND 4 4 сл

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) д(1 4 G 01 Ы 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР подЕ м из Ре (21) 3531716/28-13 (22) 27.12.82 (46) 15.07.86. Бюл. У 26 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (72) Г. Г. Иванов (BG), М.Ю. Зуева и B.М. Земсков (SU) (53) 612.015 ° 1 (088.8) (56) Ъ11Ктап-соййеЕt. .J. et. а(.

Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973, 51, 9 4, 1097-1104. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МИОЗИНА ИЗ

МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ СЕРДЦА (57) Изобретение относится к биохимии и иммунологии. Цель изобретения — упрощение способа, повышение . активности и выхода целевого продукта. Мышечную ткань сердца гомогенизируют 4 раза по 10 с при 2500026000 об/мин в буфере ° Затем центрифугируют при 22000 g в течение

20 мин. Актин удаляют из раствора с концентрацией белка 4-6 мг/мл центрифугированием при 180000200000 g в течение 1,5 ч. Ииозин осаждают при рН 5,6-5,7. Фракцию продукта при насыщении 42,57 сульфатом аммония диализуют и центрифугируют.

Нижний слой супернатанта используют в качестве собственно препарата миозина. 4 табл.

1244591

Изобретение относится к биологии и медицине, а точнее к биохимии и иммунологии. Предлагаемый способ дает возможность получить иммунологически чистые высокоактивные ирена- 5 раты миозина из любых поперечно-полосатых мьппц (как скелетных, так и сердечных), которые могут быть использованы в энзимологических, в частности кинематических исследова- 10 пнях при изучении топкой структуры ггышц, а также в качестве чистого антигена при диагностике воспалительных процессов в мьппцах с помощью клеточных реакций — реакцип пассив- 15 ной гем1гглютцнации, выявляющей противокардиапьные антитела, реакции торможения миграции лейкоцитов,реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Цель изобретения — упрощение спо- 20 соба, повышение активности и выхода целевого продукта.

Пример 1. Получение препарата иэ сердца человека.

Сердце брали через 1,5-2 ч после 25 смерти, наступившей в результате несчастного случая. Ииознн выделяли егз левого желудо мгка ° HpoïÎjt11ëè перфузгпо раствором Кребс-Хепэеляйт ггрн с

;37 С, удалялн предсердия, соеди30 иительную ткань, и, измельчив ножницами, гомогенизировали 4 раза по

10 с на высокоскоростном гомогенизаторе при 25000 об/мпн в 2,5 объеггах буфера, содержащего 0,05 И, КН, РОг,, О, 001 И ДТТ, О, 01 И NagР, О,, 0.001 И ЭДТА, рН 6,8. Далее центрифугировали 15 мин нри 10000 g и осадок вновь гомогенизировали в том же скоростном режиме ? раза по 10 с в

3-х объемах среды, содержащей 0,3 И

KCL, 0,1 И КН, РО1, 0,01 И Г1аггРг 01, 0,001 И ЭДТА, рН 6,8.Затем проводили экстракцию путем интенсивного перемешивания стеклянной палочкой в течение 7-8 мин и центрифугировали ..15 мин при 10000 g. Полученный супернатант фильтровали через три слоя марли для удаления жира, а к фильтрату добавляли 9 объемов воды с 0,001 И ЭДТА и доводили рН до

6,5-6,7 двухмолярным раствором HCl.

Затем центрифугировали при 10000 g

15 мин, уплотненный осадок разводили средой, содержащей 0,01 И ТрпсНС1, 0,5 И KCL, 0,001 И ЭДТА, 0,05 И

Г,.дС1 и 0,001 1I ДТТ, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл, которую опреде0,515 Н(Б -Я» ) 1-S, 0,272 где V

8г сд объем раствора в мл, исходное насьпцение, требующееся насыщение, количество соли, r.

Фракцгпо, полученную при 42,5% насыщения, диализовали в течение

2 сут. против 0,05 И Трис-НС1, 0,001 И ДТТ и 0,5 И KCI. рН 7,5, а затем осветляли центрифугивованием ляли по биурету. Центрифугировали

20 мип при 22000 g. Осветленный супернатант разбавляли до концентрации .

4-6 мг/мл той же средой и добавляли

ЛТФ до конечной концентрации 0,002 H.

Раствор выдерживали 10 мин при периодическом помешивании, а затем центрифугировали в течение 1,5 ч при

180000 g c целью избавления от выпавшего в полимерной форме актина. 3атсм снижали ионную силу супернатанта от 0,5 до .0,3 N, разбавив его водой с ЭДТА, и доводили рН до 6,6.Раствор ггиоэина центрифугировали при 15000 g

20 мин, освобождаясь от осаждавшегося актомиозинового комплекса.

Для удаления пз раствора белка нуклеиновых кислот к супернатанту добавляли составлявший 30% от объеь1а сефадекс ДЕЛЕ-25,предварительно заряженный и уравновешенный 0,1 И

Трис-НС1 буфером рН 7,6, содержащим

0,2 И KCL. Через 15 мин сефадекс удалялп с помощью стеклянного фильтра я-I. Ионную силу фильтрата увеличивали до 0,3 путем добавления ЗИ КС!.

Раствор белка с рН 6,6 разбавляли семью объемами воды с ЭДТА, доводили рН до 5,7 и центрифугировали

15 мин при 10000 g. Осадок с концентрацией 2 мг/мл, определенной по биурету, суспендировали в 0,05 И пи,рофосфатном буфере рН 7 5 содержащем 0,001 И ЭДТА и 0,001 И ДТТ.

Затем вновь добавляли АТФ до конечной концентрации 0,002 H и проводили высаливание сухим сульфатом аммония при насыщении 35, 37,5 и 42,5%, чередуя преципитацию на холоде (0,5 С} и дентрифугнрование при 10000 g

15 мин, постепенно избавляясь от примесей. Количество добавляемой соли на каждой стадии высаливания рассчитывалп по следующей формуле:

1 244591

Сердце кролика

Сердце собаки

Сердце крысы

Белые

1,0 +0,05

1,5+ 0,08

1,5+ 0,09

25 мышцы кролика

Красные л ышцы кролика

Скелет1,6+0,1

20 t0

0,5+0,02

10 ные мыш!

Сердце крысы

280

1,5

Сердце . кролика

320

1,0

Сердце собаки

300 1,5

Белые

5Х

0,5%

0 5%

6% удельная активность (мкмоль/мин- мг белка) Вид препарата, объект

Количество экспериментов

Сердце человека 5 2,07-+ 0,11 при 180000 g 1,5 ч, нижний слой супернатанта использовани в качестве собственно препарата миозина.удельная активность полученного препарата составляла 2,0 ед., выход — 310 мг/

/100 г ткани.

Пример 2. Получение препаратов миозина из сердец крысы, кроли-. ка, собаки.

Выделение проводили аналогично примеру 1.

Объект

Выход, Активность, мг/100 r унив. ед. ткани

Пример 3. Выделение миозина из скелетных мьппц.

Препараты были получены из: четырехглавой мьппцы бедра человека; красных мышц кролика, белых мышц кролика.

Скелетные мышцы измельчали с помощью мясорубки после размораживания в 0,05 И фосфатном буфере, рН

6,8 + 0,001 И ЭДТА + 0,01 И пирофосфата натрия + 0,001 И ДТТ, а далее выделение проводили аналогично примеру 1. Выход составлял: для препарата из скелетной мышцы человека

280 мг/100 r ткани, а для препаратов из белых и красных мьппц кролика 300 и 290 мг/100 r ткани соответственно.

Пример 4. Воспроизводимость предлагаемого способа.

В качестве критерия воспроизводимости использовалась средняя вели чина удельной активности данного вида препарата. цы человека 5 0,14+ 0,01

Максимальное отклонение от среднего значения активности препарата данного вида составляло не более

6Х и не зависело от объекта.

Пример 5. Данные чистоты полученных препаратов.

Данные электрофореза в ПААГ.

Объект Примеси с М.в,(10 с М.в>10 "

3„ мышцы

«ролика 0,5Х

30 Красные мышцы кролика 6Х

Сердце кролика 6Х

35 Сердце собаки 0,5%

Сердце человека 1% 9Х

О количестве примесей нуклеи40 новых кислот судили по соотношению

Еио

Е гоо

Белые мышцы кролика 1,94

Красные мьппцы кролика 1,72

Сердце кролика 1,76

Сердце собаки 1,75

Сердце человека 1,78

Сердце крысы 1,71

Скелет мышцы человека 1,75

Полученные препараты миозина являются иммунологически чистыми, что дает возможность использовать их в качестве чистых антигенов, в частности, при диагностике сердечных заболеваний. Предлагаемый способ дает возможность получить высокоактивные препараты из любого вида поперечно1 244591

Формула из обретения

Составитель В. Кчзьмичев

Техред Л.Олейник Корректор С. Шекмар

Редактор Ю, Середа

Заказ 3910/48

Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная,4 полосатых мышц разных животных и человека. Время выделения сокращено по сравнению с известным способом на 12 ч.

Способ выделения миозина из мышечной ткани сердца путем гомогениэации ткани, экстракции буфером, фильтрования, центрифугирования, хро. матографии, фракционирования сульфатом аммония, последующего центрифугирования и диализа, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения активности и выхода целевого продукта, ткань го> могенизируют 4 раза по 10 с при

25000-26000 об/мин, центрифугируют при 22000 g в течение 20 мин, актин удаляют из раствора с концентрацией белка 4-6 мг/мл центри1О фугированием при 180000-200000 g в течение 1,5 ч, миозин осаждают при рН 5,6-5,7, фракцию продукта при насыщении 42,5 Е сульфатом аммония диализируют и центрифугиру15 ют.