Способ получения гибридных плазмид,содержащих структурные гены и вектор,передающий устройчивость к гигромицину в и g 418

 

. СОЮЭ СоаЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН сЮ 4 .С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

Balll

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ. (21) 3452106/30-15 (22) 16. 06. 82 (31) 362215 (32) 26. 03. 82 (33) US (46) 07.08.86. Бюл. N 29 (71) Эли Лилли Энд Компани (US) (72) Роберт Фрэнк Сантерре (US) и Рамачандра Нагараджа Pao (IN) (53) 576.8(088.8) (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДHbIX ПЛАЗМИД, СОДЕРЖАЩИХ СТРУКТУРНЫЕ

ГЕНЫ И ВЕКТОР, IIEPEPAI05HP УСТОЙЧИВОСТЬ К ГИГРОМИЦИНУ В И G418, о т

„„SU „„1250174 А 5 л и ч а ю шийся тем, что получают вектор, передающий устойчиврсть к гигромицину В и G418 путем обработки плазмиды рКС203 ферментом рестрикции BR1 II с. образованием фрагмента 7,5 кв Bgl II, или ферментами рестрикции Bgl II u Sal I с образованием фрагмента 1,51 кв

Sal I/Bgl II, или ферментами .рестрикции Sal I u EcoR I с образованием фрагмента 1,65 кв ЕсоР I/Sal I, поПУЧенные таким образом фрагменты плазмиды рКС203 смешивают с фрагментами, которые содержат структурные гены, и сшивают ДНК лигаэой фага Т4.

1250174

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду рКС222 получают обработкой плазмиды рКС7 . ферментами рестрикции Sal I u Bgl I с последующим сшиванием полученных фрагментов с фрагментами 2,75 кв

Sal I/Bgl II.

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду pSC701 получают сшиванием фрагментов 7,5 кв

Bgl ll.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду рКС257 получают обработкой плазмиды р$С70.1 ферментом рестрикции Нае II, а затем полученные фрагменты сшивают.

5. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду рКС261 получают обработкой плазмиды рКС257 ферментом рестрикции $ас I„ а затем полученные фрагменты сшивают.

6. Способ по п.1, отличаю— шийся тем, что плазмиду рКС275 получают обработкой ферментом Нае II плазмиды рКС261 и pUR222, а затем полученные фрагменты сшивают.

7. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду рКС264 получают обработкой ферментом рест.рикции EcoR I плазмид рКС259 и уЕР24, затем полученные фрагменты сшивают.

8. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиды рКС214 и рКС215 получают обработкой плаз.миды pSV5gpt ферментом рестрикции

B 1 II с последующим сшиванием полученных фрагментов с 7, 5 кв Bgl II фрагментами плазмиды рКС203.

9. Способ по п.1, о т л и ч а.ю— шийся тем, что плазмиды рСЭ Х и pGD 2 получают обработкой плазмиды рХС669 ферментом рестрикции

Bam HI с последующим сшиванием полученных фрагментов с 7,5 кв Bgl II фрагментами плазмиды рКС203.

10. Способ по п.1, о т л и ч а — . ю шийся тем, что плазмиды рСЭЗ и pGD4 получают обработкой плазмиды рФ4 ферментом рестрикции

Hind III и добавлением Hind III связки к 7,5 кв Hind III фрагменту плазмиды рКС203 с последующим сшиванием фрагментов.

11. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что фрагмент 1,62 кв

EcoR I/Sal I получают обработкой плазмиды рКС222 ферментами рестрикции EcoR Х и Sal I.

12. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что фрагмент 1,51 кв

Sal I/Bgl II получают обработкой плазмиды рКС222 ферментами рестрикции Sac I u Bgl П .

13. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиды pGD10 и pGD11 получают обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II и добавлением к 1,5 1 кв EcoR Х/Sal I фрагменту плазмиды рКС203 Вр1 II связки, а затем полученные фрагменты сшивают.

14. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что плазмиды pGD 12 и рСП 13 получают обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом рестрикции

Bgl ХХ и добавлением к 1,65 кв

EcoR I/Sal I фрагменту плазмиды рКС203 Bgl II связки, а затем полученные фрагменты сшивают.

15. Способ по п.1, отличаю— шийся тем, что плазмиды pGD14 и pGD15 получают обработкой плазмиды

p$U5gpt ферментом рестрикции Bgl и добавлением к 2, 7 5 кв B al/Вф Ц фрагмеь ту плазмидырКС203В Ц связки,а затем полученные фрагментысшивают.

16. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиды pL0314 и pL0315 получают обработкой плазмид рКС259 и pSV5gpt ферментом рестрикции Bgl II, а затем полученные фрагменты сшивают.

17. Способ по п.1, о т л и ч а ю — . шийся тем, что плазмиды pL0316 и pL0317 получают обработкой плазми- . ды рКС257 ферментом рестрикции Sal Х, добавлением Bgl связки к Sac I окончанию линейной последовательности

ДНК и обработкой плазмиды pSV5gpt ферментом, рестрикции, Bgl II а затем полученные фрагменты сшивают.

18. Способ по п.1, о т л и M а ю— .шийся тем, что плазмиды рХ0320 и pL0321 получают обработкой плазмиды рКС275 ферментом рестрикции $ас I, добавлением Bgl II связки к Sac Х окончанию линейной последовательности ДНК и обработкой плазмиды р$Ч58рс ферментом рестрикции Bgl II, затем полученные фрагменты сшивают.

19. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что плазмиду pL0378 получают обработкой плазмиды рВК322 ферментом рестрикции pSt1 и плазмиды рКС264 ферментом рестрикции pSt1 затем полученные фрагменты сшивают.

1250174

Эппендорфа емкостью 1,5 мл и центрифугируют около 15 с. Если нет других указаний, все манипуляции осуществляются при комнатной температуре. Образовавшийся верхний слой осторожно удаляют тонким наконечником аспиратора, и клеточный осадок суспендируют примерно в 100 рл свежеприготовленного лиэоцимного. раствора, который содержит 2 мг/мл лиэоцима, 50 мм глюкозы, 10 мм ЦДТА (пиклогександи- аминотетраацетата) и 25 мм трис-НСГ (рН 8,0). После инкубации при О С в течение 30 мин прибавляют примерно

200 рл щелочного раствора НДС (натрийдодецилсульфата) (0,2 í. NaOH, 1% НДС) и трубку осторожно встряхивают, а затем выдерживают 15 мин при

0 С. Прибавляют примерно 150 ул

3-молярного ацетата натрия (приготовленного растворением 3 моль ацетата натрия в минимальном количестве воды, установлением,рН 4,8 с помощью ледяной уксусной кислоты, а затем доведением объема до 1 л) и затем содержимое трубки осторожно перемешивают перевертыванием в течение нескольких секунд, во время которых образуется сгусток ДНК. о

Трубку вьдерживают при 0 С в течение 60 мин, а затем центрифугируют

5 мин, получая почти прозрачный верхний слой. Переносят примерно

0,4 мл верхнего слоя во вторую центрифужную трубку, куда добавляют 1 мл холодного этанола. После вьдерживания . трубки при -20 С в течение 30 мин полученный осадок собирают цеитрифугированием (2 мин) и удалением верхнего слоя аспиратором. Растворяют собранный таким образом осадок в

100 Цл 0,1 молярном ацетате натрия (0,05 М трис-НС1, рН 8) и повторно осаждают добавлением 2 объемов холодного этанола. После 10 мин при

20 С осадок собирают центрифугированием, как описано вышее. Он представляет собой требуемую плазмиду ДНК

Е.coli JR225. .Б,Трансформация Е.coli JR225 плазмиды ДНК и вьделение плаэмиды рКС203.

Растворяют осадок Е.coli JR225 плазмиды ДНК в примерно 100 р л 0,1молярного ацетата натрия (0,05 M трис-НСВ, рН 8) и осаждают 2 объемами холодного этанола. Собирают полученную плазмиду ДНК и затем растворя ют примернов 40 рл воды илн разбав10

35

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к получению гибрид ных плаэмид, содержащих последовательность ДНК, передающую устойчивость к гигромицину, 5

На фиг. 1-10 представлены карты плазмид рКС203, pSV5gpt, рКС2 14, рКС215, рКС222, рSC701, рКС257, рКС259, рКС261, pRC275, рКС259,. рКС261, рКС275, рКС264, р?.0378 и рКС273 соответственно.

° В описании использована следующая терминология.

Структурный ген — последовательность ДНК, которая кодирует полипептид.

Контрольный элемент — последовательность ДНК, которая частично промотирует и регулирует экспрессию структурального гена.

Эукариотный нромотор — последовательность ДНК, которая частично промотирует и регулирует экспрессию структурального гена в эукариотной клетке °

Прокариотный репликон — последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует репликацию ДНК в прокариотной клетке.

Клонирующий вектор рекомбинантной 30

ДНК вЂ” любой агент, включая, плазмиды, I бактериофаги и -вирусы, состоящий из молекулы ДНК, к которой могут быть добавлены один или более допольительных сегментов ДНК.

Трансформация — введение ДНК в реципиент †клетку хозяина, которое изменяет генотип и, следовательно, приводит к стабильному и наследуемому изменению в клетке-реципиенте. 40

Вставной изомер — одна из двух или более возможных рекомбинантных молекул ДНК, образовавшихся при вставке фрагмента ДНК, в один из двух или более совместных центров на реципи- 45 .енте ДНК.

Пример 1. Плазмида рКС203 (фиг. 1) .

А. Вьделение плазмиды ДНК иэ Е.coli

JR225. 50

Культивируют бактерии Е.coli JR225 (АТСС У 31912) в ТД-бульоне (1X триптона, 0,5Х дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, рН 7,4) со

100 р гlрл антибиотика гигромицина В 55 традиционным микробиологическим методом. После 18 ч инкубации примерно

0,5.мл культуры переносят в трубку

1250174 ляют буфером и, наконец, используют для трансформации Е.coli K12 ВЕ827 в соответствии с методикой трансформации (TrJensink, l974, Ñål1 3:315).

Е,cali К12 ВЕ827 хранится вАмерикан- 5 ской коллекциитипов культур Рокквилл, Мэрилэнд, номер АТСС 31911 Полученные трансформанты отбирают на ТДагаре (1X триптона, 0,5 дрожжевого экстракта, 0,5 хлористого натрия, 10

1,5 . агара., рН. 7,4), содержащем

200 pr/ìë антибиотика гигромицина В.

Некоторые из трансформантов, как показано гель-электрофорезом и другими тестами, содержат как большие, так и меньшие (15 кв) плазмиды и являются устойчивыми как к антибиотику ампициллину, так и к гигромицину

В. Другие трансформанты содержат только меньшую, чем 15 кв плазмиду gg и являются устойчивыми к антибиотикам гигромицину В и С418, но являются чувствительными к ампициллину.

Трансформанты последнего типа помещают на ТД-агар, содержащий 1 мг/мл 25 антибиотика гигромицина В, и культивируют с использованием стандартных микробиологических методик. Используют полученные клетки в соответствии с процедурой примера 1А для выделения описанной устойчивой к гигромицину В и С418 15 кв плазмиды-. плазмиды рКС203. Наличие генов устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С418 в плазмиде рКС203 подтверждается последующей трансформацией и селекционным анализом.

Пример 2. Выделение генов устойчивости к антибиотикам гигроми-, цину В и С418 и контрольных элементов.

35

Обрабатывают примерно 5 pr плазмиды рКС203! ДНК: В@1 Хт рестрикционным ферментом в соответствии с известной методикой, Рестрикционные ферменты и 45 инструкции, могут быть получены из следующих источников: Бетесда Рисерч

Лабораториз Инк., Бокс 6010, Рокквилл, Мэрилэнд 20850, Боерингер Маннхейм

Биохемикалс 7941 Кастлевей Драйв П.О, Бокс 50816 Индианаполис. Индиана

46250, Нью Инглэнд Био Лабс., Инк.

283 Кэбот. Беверли, Массачусеттс

01915, Рисерч Продактс Милс Лабораториз Инк., Элкхарт, Индиана 46515. Из 55

7 5 5 8 и 0 5 кв фрагментов собирают 7,5 кв Вя1 ХТ фрагмент, содержащий требуемые гены устойчивости к антибиотикам гигромицину В и С418 и контрольные элементы. Это подтверждается трансформацией и селекционным анализом, который показывает, что клетки, которые обычно являются чувствительными к антибиотикам гигромицину В и С418, являются устойчивыми при трансформации 7,5 кв Bgl II фрагмента.

Пример 3. Конструирование плазмид рКС214 (фиг.2) и рКС215 (фиг.4) и трансформантов Е.coli К12

ВЕ827/рКС214 и Е.coli К12 ВЕ827/рКС215, Плазмида рБЧ5@рс,(фиг.2), конструкция которой описана Муллиганом и Бергом, 1980, Schience 209/4463/: 1422, имеет только один участок Bgl II в

gpt-гене. Клонирование позволяет осуществить экспрессию генов устойчивости кантибиотикам гигромицинуВ иС418 °

Обрабатывают около 5 Pr плазмиды

pSV5gpt gHK Bgl II рестрикционным ферментом в соответствии с известной методикой. После инактивации фермента при нагревании в течение 5 мин о при 70 С смешивают примерно 1 p r

ДНК в соотношении 1:1 с 7,5 кв Bgl II фрагментом рКС203. Фрагменты соединяют, используя ДНК-лигазу фага Т4.

ДНК-лигаза и инструкции могут быть получены из следующих источников:

Бетесда Рисерч Лабораториз, Бокс 6010, Рокквилл, Мэрилэнд 20850.

Лигатированную смесь используют для трансформации Е.coli К12 ВЕ827 в соответствии с известной методикой (Vensink 1974, Cell 3:315) на ТДпластинах, содержащих 100 рг/мл каждого из антибиотиков ампициллина и апрамицина. Рекомбинантные клоны помещают на ТД-пластины, содержащие

100,pr/мл ампициллина-и 200 pr/мл антибиотика гигромицина В. Около по- ловины рекомбинантных клонов, устой-. чивых к антибиотику,гигромицину В, содержат плазмиду рКС214 (фиг.3), тогда как остальные содержат плазмиду рКС215.

Выделяют плазмиду ДНК из приведенных клонов в соответствии с методикой примера 1А и идентифицируют рестрикционным ферментным анализом.

Так же индентифицируют сконструированные плазмиды рКС214 и рКС215 и сконструированные трансформанты

Е.coli К12 ВЕ827/рКС214 и Е.coli K12

ВЕ827/рКС215 и затем выделяют для дальнейшего использования.

1250174

Пример 4. Конструирование клеток Мышь Ltk /рКС214, Культивируют клетки Мышь Ltk регулярным сохранением клеток в среде содержащей минимум основной среды с солями Ирла (Earle) и неосновных а аминокислот (Eagle 1959, Science

130:432), 107 объем/объем сыворотки новорожденного теленка и 292 г/мл глютамина. Культивированные таким образом клетки Мьппь Ltk затем тран сформируют плазмидой рКС214 известным способом по методике Виглера с сотр. 1979, Proc,Nat.Àñàä.Sci.USA

76/3/:1373, с тем исключением, что прибавляют 100-300 нг плазмиды ДНК на каждую пластину в 1 мл осажденного фосфата кальция ° Культивируют среду описанным образом. После 4 ч .инкубации при 37 С среду переносят а свежую среду и культивируют клетки еще 20 ч. В это время осуществляют давление отбора антибиотиком — гигромицином В, заменяя среду селектив ной, дополнительно содержащей 751000 нг/мл антибиотика гигромицина

В. Предпочтительная концентрация антибиотика для селекционной среды

200 / г/мл. Селективную среду заменяют после первого дня, затем через " два дня и, наконец, на каждый третий день в течение 2-3 недель, во время которых вырастают трансформант ные клоны. Колонии собирают вручную, используя пипетку, и выращивают в массовой культуре при непрерывном давлении отбора. Культивированные таким образом устойчивые к гигромицину В клетки включают требуемые трансформанты Хьппь Ltk pKC214.

Пример 5. Конструирование клеток Мьппь Ltk рКС215.

Конструируют клетки Мьппь Ltk рКС215 в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что для трансформации используют не плазмиду рКС214, а плазмиду рКС215.

Сконструированные таким образом трансформанты Мышь Ltk рКС216 затем выращивают в массовой культуре.

Пример 6. Устойчивость тран- сшормантов к .антибиотикам гигромицину В и С418.

Способность плазмид рКС203, рКС214 и рКС215 придавать устой %вость к антибиотикам гигромицину В и С418 опре" деляют путем испытания трансформированных и не трансформированных клеток Е.coli u Мьш ь Ltk на рост в среде с различным количеством анти" биотиков.. Среда.и условия культивирования для клеток Е.coli и Мьппь Ltk то же, что и в примерах 1А и 4. Результаты испытаний устойчивости к гигромицину В даны в табл ° 1, к гигро10 мицину С418 — в табл.2.

Клетки Мьппь Ltk рКС214 и Мьппь Ltk рКС215 не только воспроизводятся при концентрации 400 пг/мл, но выживают и при.,более высоких концентрациях, превышающих 1000 рг/мл.

Пример 7. Конструирование плазмид рСД1 и рСД2 и трансформантов Е.coli .К12 ВЕ827/рСД1 и Е.coli

К12 ВЕ827/рСД2.

20 в

Плазмида рЬС669 конструкция котор рой описана Guarente and Ptashne

1981, Proc, Nat. Acad. Sci, USA

78/4/:2199, содержит единственный рестрикционный ВатпН1 участок в цитохромном гене. Клонирование 7,5 кв

Bgl II фрагмента плазмиды рКС203 в этот участок позволяет произвести экспрессию гена устойчивости к антибиотику гигромицину В, Требуемую вставку легко осуществить, так как

Bgl II фрагменты содержат 5 протяженностей с последовательностью ГАТК, .которые являются идентичными .5-ти протяженностям BamH I фрагментов.

Следовательно, Bgl II фрагменты и

Bam II фрагменты являются совместимыми и могут быть легко связаны для

,.получения рекомбинантов .

Плазмиды рСД1 и рСД2 и трансформанты Е.coli К12 ВЕ827/рСД1 и Е.coli

Ki2 ВЕ827/рСД2 конструируют в соответствии с методикой примера 3 с, но с использованием плазмиды pLC699 с одним участком ВашН I вместо плаз 4 миды pSV5gpt В зависимости от ориентации Bgl II фрагмента получают плазмиды с двумя ориентациями. Плазмида рСД1 означает рекомбинантные плазмиды, в которых Sali рестрикционный участок ближе к ura-гену. Плазмида рСД2 означает плазмиды с обратной ориентацией.

Пример 8. Конструирование клеток Saccharomyces cerevisiae/pClII

Выращивают дрожжи Saccharomyces

cerev1s1ae на 17 дрожжевом экстракте (2X бактопептона) с использованием традиционных микробиологических про1250174 цедур. Трансформацию плазмиды рСД1 в дрожжи осуществляют в соответствии с известной методикой Hinnen at all.

1978, Proc. Nat. Асад. Sci. VSA

75:1929. Отбирают трансформанты при добавлении летальных доз антибиотика гигромицина В к культуральной среде.

Пример 9. Конструирование 10 клеток Saccharomyces cerevisiae/ðCÄ2.

Трансформанты конструируют в соответствии с методикой примера 8 с тем исключением, что используют плазмиду рСД2 вместо плазмиды рСД1.. 15

Пример 10. Конструирование плазмид рСДЗ и рСД4 и трансформантов

Е.coli K12 ВЕ827/рСДЗ и Е.coli К12

ВЕ827/рСД4.

Плазмида р04, конструкция которой 20 описана Solnick 1981, Cell 24:135, содержит большую часть Аденовируса 2 (Л ?) позднего промотора на карте, скоординированной 15,4 (EcoR I) до.

16,6 (Hind III). Клонирование 7,5 кв

Bpl II фрагмента плазмиды рКС203 в

Hind III участок плазмиды р04 позволяет произвести экспрессию гена устойчивости к антибиотику гигромицину В. 30

Требуемую конструкцию получают при добавлении в соответствии с известной методикой Ульриха с сотр. (1977

Science 196:1313) Hind III связок к

7,5 кв Bgl II фрагменту и последующего связывания модифицированного таким образом фрагмента с Hind III обработанной плазмидой р04 при использовании Т4 ДНК-лигазы. (Hind III

/d/ККААГКТТГГ/ и другие связки до- ® ступны из Коллаборатив Рисерч Инк., 1365 Мэйн Стрит, Вальтам, MA 02154)

После обеспечения 7,5 кв Bgl II фрагмента Hind III связками проводят связывание фрагмента в плазмиду р04 для образования плазмид рСДЗ и рСД4 в соответствии с методикой примера 3.

Последующую трансформацию в Е.coli

К12 ВЕ827 для образования Eicoli К12

ВЕ827/рСДЗ и Е.coli К12 ВЕ827/рСД4 также проводят в соответствии с методикой примера 3.

Как и в примерах 3 и 7, плазмиды двух ориентаций получают в зависимости От Ориентации вставленного придаю- 55 щего устойчивость фрагмента. Плазми" да рСДЗ означает рекомбинантные плаэмиды, в которых Sal Х рестрикционный участок вставленного придающего устойчивость к антибиотику гигромицину В фрагмента ближе с EcoR I центру Ad2 промотора. Плазмида рСД4 означает плаэмиды с обратной ориентацией.

Пример 11. Конструирование клеток smb Ltk /рСДЗ.

Проводят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что .используют плазмиду рСДЗ вместо плазмиды рКС214.

П, р и м е р 12. Конструирование клеток Мышь Ltk /ðCË4.

Проводят по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду рСД4 вместо плазмиды рКС215.

Пример 13, Конструирование плазмиды рКС222 и трансформанта

Е.coli К12 ВЕ827/рКС222.

А. Выделение 2,75 кв Sal I/Bgl II фрагмента плазмиды рКС203.

Обрабатывают. известным способом по методике, упомянутой в примере 3, примерно 5P!r плазмиды рКС203 ДНК Sal I u

Bgl II рестрикционными ферментами.

Выделяют традиционным способом 2,75 кв фрагмент, который содержит гены и контрольные последовательности устойчивости к антибиотикам гигромици, ну В и G418.

Б. Связывание и окончательное конструирование.

Обрабатывают примерно 5„ г плазмиды рКС7, конструкция которой описана

Рао и Роджером, 1979, Cell, 7:79, Sal I u Bgl II рестрикционныйи ферментами. После инактивации ферментов о при нагревании при 70 С в течение

5 мин примерно 1 Pr ДНК смешивают в соотношении 1:1 с 2,75 кв Яа1 1/Bgl II фрагментом рКС203. Соединяют фрагменты, используя Т4 ДНК-лигазу, в соответствии с методикой примера 3. Полученную плазмиду рКС222 трансформируют в Е.coli K12 также по методике примера 3. Получают приданную устойчивость к антибиотикам ампициллину, ги ромицину В и С418.

Пример 14. Выделение 1 51 кв

Sac I/Bgl II фрагмента плазмиды рКС222 (фиг. 5), придающего устойчивость к гигромицину В.

Выделяют требуемый фрагмент ДНК в соответствии с методикой примера

13А с тем исключением, что для ре1250174 стрикционного переваривания Bgl II сформации используют плазмиду рСД11, используют Sac I, а не Sal Е. а не плазмиду рКС214. СконструироПример 15. Выделение 1,65 кв ванная таким образом Мышь Ltd /рСД11

ЕсоР. I/Sal I фрагмента плазмиды 5 может быть выращена в массовой кульрКС222, придающего устойчивость к туре. гигромицину С418. Пример 19. Конструирование

Выделяют требуемый фрагмент ДНК в, плазмид рСД12 и рСД13 и трансфорсоответствии с методикой примера 13А мантов Е.coli K12 ВЕ827/рСД12 и с тем исключением, что для рестрикци- 10 .Е.coli К12 ВЕ827/рСД13. онного переваривания используют Плазмиды конструируют в соответEcoR I, а не Bgl II, с Sal ствии с методикой примеров 3 и 10

1 Пример 16, Конструирование с тем исключением, что 1,65 кв плазмид рСД10 и рСД11 и трансформан- EcoR I/Sal I фрагмент плазмиды тов Е.coli К12 ВЕ827/рСД10 и Е.coli 15 рКС222 используют вместо 7,5 кв

К12 ВЕ827/рСД1 1. Bgl II .фрагмента плазмиды рКс203 и Вд1 II, а не Hind Ш связки при..Конструируют требуемые плазмиды соединяют к придающему устойчивость по методике примеров 3 и 10, .с тем исключением, что используют 1,51 кв к антибиотику фрагменту. 1

20 фрагмент с Bgl II связками вставля$ас Т/Вр1 ?Т фрагмент плазмиды . рКС222 вместо 7,5 кв В81 II фраг- ют в. Плаз щу PSV5gpt в соответств мента плазмиды рКС203 и к придающему с методикой примера 3.

Как и в примере 16 получают плазустойчивость к антибиотикам фрагменту присоединяют g, a не in

В 1 II Н Й Ilj миды двух ориентаций. Плазмида рСД12 означает рекомбинантные связки. 1,51 кв фрагмент в В81 плазмиды, в которых Pat I рестриксвязками. вставляют в плазмиду pSVSgpt по методике примера 3. ционный участок уставленного придающего устойчивость к антибиотику

С4 18 фрагмента ближе к Н1пд Ш плазмиды двух ориентаций в зависи30 участку арс-гена. Плазмида рСД13 мости от ориентации вставленного означает плазмиды с обратной ориенфрагмента," придающего устойчивость тацией. к антибиотику. Плазмида рСД10 означает рекомбинантные плазмиды, в коТрансформация плазмид рСД12 и рС 13 в Е.coli K12 ВЕ827 соответственно с торых Ava I рестрикционный участок вставленного придающего устойчивость 35 образованием Е.coli К12 ВЕ827/РСД12 ! к гигромицину В фрагмента ближе к

Н1пд III acTKy gpt-гена. П аз а водится в соответствии с методикой рСД11 означает плазмиды с обратной примера 3, с тем исключением что м сключением, что ориентацией. для селекции трансформантов используа мид СД10 и

Трансформацию плазмид рСД

40 ют антибиотик С418, а не гигроми рСД11 в Е.coli К12 ВЕ827 с образовацин,В. кием соответственно Е.coli K12 Пример 20. Конструирование

ВЕ827/рСД10 и Е.coli К12 ВЕ827/рСД11 клеток Мышь Ltk /рСД12. осуществляют по методике примера 3. Конструирование осуществляют в соПример 17. Конструирование .ответствии с методикой примера 4, с

45 клеток Мьппь Ltk /рСД10. тем исключением, что при трансформаКонструирование осуществляют в со- ции используют плазмиду рСД12, а не ответствии с методикой примера 4 с плазмиду рКС214 и для селекции трантем исключением, что используют плаз. сформантов используют антибиотик миду рСД10, а не плазмиду рКС214 С418, а не гигромицин В. Сконструи50 . при трансформации. Сконструированная рованные таким образом Мьппь таким образом Мьппь Ьс1 /рСД10 может Ltk /рСД12 могут быть выращены в быть выращена в массовой культуре. массовой культуре.

Пример 18. Конструирование Пример 21. Конструирование клеток Мьппь Ltk /рСД11. клеток Мьппь Естес /рСД13.

Проводят конструированйе в соответ. Конструирование осуществляют в соствии с методикой примера 4 с тем ответствии с методикой примера 4, с исключением, что в процедуре тран- тем исключением, что при трансформа-т11 1250 ции используют плазмиду рСД13, а не плазмиду рКС2 14, и для селекции трансформантов используют антибиотик С418, а не гигромицин В. СконЬ струированные таким образом Мышь

Ltk /рСД13 могут быть выращены в массовой культуре., Пример 22. Конструирование плазмид рСД14 и рСД15 и трансформантов Е.coli К12 ВЕ827/рСД14 и Е.coli lp

ВЕ827/рСД15.

Выделяют 2,75 кв Sal I/Bgl II рагмент плазмиды рКС203 по методике примера 13. Затем присоединяют молекулярные связки в соответствии с методикой примера 10, с тем исклю-. чением, что используют Bgl II, а не

Hind III связки. Полученный фрагмент затем вставляют в плазмиду pSV5gpt по методике примера 3 для образова- 2р ния желаемой плазмиды.

Как и в примере 16, получают плазмиды двух ориентаций. Плазмида рСД14 означает рекомбинантные плазмиды, в которых Ava 1 рестрикционный участок 25

l придающего устойчивость к антибиотику фрагмента ближе к Hind III участку gpt-гена. Плазмида рСД15 означает плазмиды с обратной ориентацией. 30

Трансформацию плазмид рСД 4 и рСД15 в E.coli К12 BF827 для образования соответственно Е.coli К12 ВЕ827/рСД14 и Е.coli К12 BE827/рСД15 также проводят по методике примера 3.

Пример 23. Конструирование клеток Мышь Ltk /рСД14.

Конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформа- 4О ции используют плазмиду рСД14, а не плазмнду рКС214. Сконструированный

Мьппь Ltk /рСД14 может быть выращен в массовой культуре.

Пример 24. Конструирование 45 клеток Мьппь Ltk /рСД15.

Осуществляют конструирование в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что при трансформации используют плазмиду рСД15, а не плазмиду рКС214. Сконструированный таким образом Мышь Ltk /рСД14 может быть выращен в массовой культуре.

Пример 25. Конструирование плазмиды pSC701 и трансформант Е.со1 5

К12 ВЕ827/pSC701.

Инкубируют при 37 С в течение 1 ч примерно 5 рл/5 pr плазмиды рКС203

174 12 (выделенной в примере 1) в TE"буфере (10 мл трис-НС0, рН 8,0, 1 мм ЭДТУК)

5 /Ол ДТТ (100 мм дитиотрейтола), 5 рл (1000 pr /ðë) БСА (бычьего сывороточного альбумина), 25 Рп воды, 5рл 10Х реакционной смеси (600 мМ

NaCl, 100 мМ трис-НСо, рН 7,4, 100 мМ MgC1<) 5 ил (5 единиц) Bgl II рестрикционйого фермента. Реакцию о заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин, затем реакционную смесь выливают на лед, экстрагируют фенолом и смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), затем осаждают этанолом. Растворяют полученные

Bgl ХТ рестрикционные фрагменты в .5 рл 5 мМ хлористого натрия и затем связывают. Связывание проводят при взаимодействии 1 ул Bgl II рестриктированной ДНК с примерно 38у л воды, 5,/ л (10 мМ) АТФ, 5 @sr связывающей смеси (500 мМ трис-HCt, рН 7,8, 200 мМ дитиотрейтола, 100 мМ МяС1 ) и 1Рл Т4 ДНК-лигазы (10. Нью Ин5

4--.- о глэнд Биолаб единиц) при 16 С в течение 16 ч.

Реакцию заканчивают инкубированием при 70 С в течение 5 мин. После охлаждения на льду используют полученную связанную смесь для трансформации Е.со1 К12 ВЕ827 по известной ме тодике транформации Mensink 1974, на ТД-пластинах, содержащих 200 р г/л, антибиотика гигромицина В. Некоторые из трансформантов, как показывает гель-электрофорез, содержат только требуемую, 7,3 кв плазмиду.

Такой трансформант Е.coli K12

ВЕ829/р$С701 — отбирают на пластинах с ТД-агаром, содержащих 200 р г/рл антибиотика гигромицина В,. а затем .культивируют, используя традиционные микробиологические методики. Полученные клетки используют для выделения плазмиды pSC701 в соответствии с методикой примера 1А. Наличие генов устойчивости к антибиотику гигромицину В и С418 в плазмиде pSC701, кроме того, подтверждается последующей трансформацией, отбором и рестриктивным ферментным анализом. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды . pSC701 дана на фиг.6.

Пример 26. Конструирование плазмид рКС257 и рКС259 и трансформанты Е.coli К12 BE783/рКС257 и

Е.coli К12 ВЕ783/рКС259.

13 1250174 14

Плазмиду готовят в соответствии с смесь 10Х (500 мМ NaCl, 60 мМ трисметодикой примера 25, с тем исключе, НС, РН 7,5, 50 мМ MgC1 ), вместо нием, что используют плазмиду pSC701 плазмиды РЯС701, Bgl II рестрикцион- и Нае II рестрикционный фермент и . ного фермента и реакционной смеси.

10Х реакционную смесь (60 мМ трис- 5 Плазмида РКС261 имеет 3,2 кв и приНС1, РН 7,4, 60 мМ MgC1<), а не дает устойчивость к гигромицину В. плазмиду РКС203 и Bgl II рестрикци- Используют полученную связанную реонный фермент и реакционную смесь. акционную смесь для трансформации

Плазмида pSC701 содержит более одно- Е.coli K12 BF783 в соответствии с го Нае II рестрикционного участка, 10 процедурой трансформации примера 25. следовательно Нае II переваривание Трансформанты — Е.coli К12 и последующее связывание приводят BE783/pKC261 — отбирают и испольк смеси различных плазмид. зуют для выделения плазмиды РКС261

Полученную связанную смесь, кото- в соответствии с примером 1А. НалиРая содержит требуемую придающую 15 чие гена устойчивости к антибиотику устойчивость к гигромицину В, 4,2кв гигромицину В в плазмиде РКС261 подплазмиду РКС257, а также придающую тверждается последующей трансформаустойчивость к апрамицину, гигроми- цией, отбором и анализом последовацинУ В и С418,. 5,0 кв, плазмидУ тельности ДНК. Рестрикционный учасРКС259, используют для трансформа- 20 ток и функциональная карта плазмиды ции )3 Е.coli К12 ВЕ873 (хранится РКС261 показаны на фиг.7. .в коллекции культур Северной регио- Пример 28. Конструирование .нальной исследовательской лабоРато- нлазмиды РКС275 (фиг. 8) и трансфор-, рии, Пеория, Иллинойс, под номером мант Е.coli К12 ВЕ1041/РКС275. В-15020) по методике трансформации 25 А, Частичная Нае II рестрикция примера 25. плазмиды РКС261.

Отбирают требуемые трансформанты, Инкубируют при 37 С в течение 1 ч помещают на пластинУ с ТД-агаром примерно 5рл (5р r) плазмиды РКС261, содеРжащим 200 Рг/мл антибиотика выделенной в примере 27, в TE-буфере гигромицина В, а затем культивируют З0 5 рл ДТТ, 5 рл (.1000 мг/мл) БСА, каждый отдельно, тРадиционными ми- 25 р л воды, 5 рл (5 единиц) Нае II кробиологическими методами. Трансфор- рестрикционного фермента и 5,/ л 10Х манты, содержащие РКС257, легко и, реакционной смеси. После завершения удобно идентифицируют с помощью реакции инкубирования при 70 С в тескрининга на устойчивость к гигроми- з чение 5 мин реакционную смесь охлажцину В, а трансформанты, содержащие дают на льду, экстрагируют фенолом и плазмиду РКС259, идентифицируют с смесью хлороформ — изоамиловый спирт помощью скрининга на устойчивость к (24:1), а затем осаждают этанолом. апрамицину и гигромицину В. Трансфор-, Полученные Нае II рестрикционные манты Е.coli K12 BE783/pKC257 40 фрагменты растворяют в 5 Рл 5 мМ

Е.coli К 12 ВЕ783/РКС259 используют NaCl. для выделения плазмид РКС257 и pKC259 B. Выделение 394пс р1 ас фрагменсоответственно по методике примера та, содержащего Нае II окончание.

1А. Наличие генов устойчивости к ан-. тибиотикам в соответствующих плазми- 45, Р. Рно Рл (5 Р

Примерно 5 л дах подтверждается последующей тран- pUR222, выделенной на Е.coli К12 сформацией, отбором и рестрикционным ВЕ1166/pUR222, в соответствии с меферментным анализом. Рестрикционный . тодикой примера 1 в ТЕ-буфере Нае II участок и функциональная карта каждой переваривают в соответствии с метоиз плазмид РКС257 и РКС259 показаны Рикой примера 28А, с тем исключени50 на фиг. 6 и 7 соответственно. ем, что реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, чтобы

Пример 27. Конструирование обеспечить полное, а не частичное плазмиды РКС261 и трансформант Е.coli переваривание. Полученные в резульК12 ВЕ783/РКС261. .тате Нае II рестрикционные фрагменПлазмиду готовят по методике при- 55 ты растворяют в 5 Jlië и 5 мМ NaCI ìåða 25, с тем исключением, что ис- . Е.coli K12 BE1166/pVR222 является пользуют плазмиду pKC257 Sau 3Af ре- штаммом, хранящимся в коллекции стрикционный фермент и реакционную культур Северной региональной иссле12501

Пример 29. Конструирование

° плазмиды рКС264 (фиг. 8) и трансформант Е.poli К12 ВЕ783/рКС264.

А. EcoR Х рестрикция плазмиды рКС259.

Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28, с тем исклю15 довательской лаборатории, Пеория, Иллинойс., под номером В-15023.

В. Связывание и трансформация, а

Проводят реакцию при 16 С в течение 16 ч примерно 4 /sr каждой из i плазмид рКС261 и плазмиды pUR222

Нае II рестрикционных фрагментов (соответственно приготовленных оо примерам 28А и В), 31„цл воды, 5 рл (10 мМ) АТФ, 5 ул связывающей смеси 1О и 1 л Т4 ДНК-лигазы (10 единиц).

После завершения реакции инкубированием при 70 С в течение 5 мин полученную связанную смесь охлаждают на льду. Затем ДНК трансформируют в . 15

Е.coli К12 ВЕ1041 хранящуюся в коллекции культур Северной региональной исследовательской. лаборатории

Пеория, Иллинойс, под номером „

В-15021, в соответствии с методикой 20 трансформации примера 25. Трансформанты, содержащие только требуемую, п 3,6 кв, плазмиду рКС275, обозначе- ны как Е.coli К12 ВЕ1041/pKC275. °

Такой трансформант отбирают, выращивают 25 на пластине, культивируют и используют для последующих выделений плазмиды. Как наличие 394ntplac-содержащего фрагмента, так и детальную структуру плазмиды рКС275 удобно определять с 30 помощью гель-электрофорезного и рестрикционного ферментного анализов.

Поскольку плазмида рКС261 имеет три Hae II рестрикционных участка, частичное Нае II переваривание приводит к смеси различных Нае II фрагментов, а далее к конструкции как плазмиды рКС275, так и различных обратных изомеров плазмиды рКС275. Рекомбинантные плазмиды щ обеих ориентаций получают так же в связи с тем, что 394ntplac-содержащий фрагмент может быть связан в любом направлении. Различно ориентированные изомеры плазмид, а также 45 полученные в результате трансформанты могут быть легко выделены и идентифицированы традиционными средствами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС275 представлены на фиг. 8.

74 l6 чением, что используют плазмиду рКС259 и Есор Х рестрикционный фермент с 10Х реакционной смесью (500 мМ NaC1, 1000 мМ трис-НСЙ, рН 7,5, 10 мМ MgCI>), а не плазмиду

pUR222 и Нае II рестрикциенный фермент с реакционной смесью. Полученные ЕсоК ? рестрикционные фрагменты растворяют в 5 л мМ NaCI.

Б. EcoR Т рестрикция плазмиды

УЕр24 для последующего выделения г РДНК;

Выделяют плазмиду УЕр24 из Е.coli

К12 ВЕ1139/УЕр24 в соответствии с методикой примера 1. Е.coli К12

BE1139/УЕр24 представляет собой штамм, хранящийся в коллекции культур Северной региональной исследовательской лабораторий, Пеория, Иллинойс, под номером В-15022. Требуемое EcoR I переваривание плазмиды

УЕр24 проводят по методике примера

29А. Полученные EcoR I рестрикционные фрагменты растворяют в 5 рл

5 мМ NaCl.

В. Связывание и трансформация.

Плазмиду рКС259, обработанную

EcoR I, и плазмиду УЕр24 (соответственно приготовленные в примерах

29А и Б) связывают и затем трансформируют в Е.coli K12 BE783 по методике примера 28В. Трансформанты, содержащие только желаемую, 7,2 кв придающую устойчивость к гигромицину В, апрамицину и С418 плазмиду, обозначают как Е.. coli K12

ВЕ783/рКС264. Такой трансформант традиционным образом отбирают, выра щивают на пластине, культивируют и используют для последующих выцелений плазмиды.

2 ДНК может быть связана в любом направлении, следовательно, плазмиду рКС264, как и плазмиды с обрат" ной ориентацией, получают по указанной процедуре. Различные плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко выделены и идентифицированы традиционными способами. Рестрикцион; ный участок и функциональная карта плазмиды рКС264 представлены на фиг.8. .Пример 30. Конструирование плазмид pL0314 и pL0315 и трансформанты Е.coli К12 ВЕ783/pL0314 и

Е.coli К12 ВЕ783/pL0315 .

А. Bgl II рестрикция плазмиды рКС259.

1250

17

Рестрикцию проводят в соответствии с методикой примера 28В, с тем исключением, что используют плазмиду рКС259 и Bgl II рестрикционный. фермент с реакционной смесью, а не плазмиду рЬР222 и Нае 11 рестрикционный фермент с реакционной смесью. Полученный в результате продукт Bgl II переваривания растворяют в 5 мМ NaC1..

Б. Bgl II рестрикция плазмиды 10

pSV5gpt., Рестрикцию проводят по методике примера 28В, с тем исключением, что используют плазмиду р8758рг. и Bgl II рестрикционный фермент с реакционной .15 смесью, а не плазмиду pUR222 и Нае II рестрикционный фермент с реакционной смесью. Полученный продукт Bgl II переваривания растворяют .в 5 мМ NaC1.

В. Связывание и трансформация. 20

Связывание проводят.по методике примера 28 В, с тем исключением, что используют Bgl ?Х переваренные плазмиды рКС259 и pSV5gpt, а не плазмиды рКС261 и pUR222. Полученную связанную смесь используют для трансформации в Е.coli К12 ВЕ783 (по методике трансформации Mensink 1974) на ТДпластинах, содержащих 200 pr/мл антибиотика гигромицина В. Некоторые Зр из трансформантов, как видно из гельэлектрофореза и других испытаний, содержат только требуемую плазмиду

pL0314 или плазмиду pL0315. Такие трансформанты отбирают, выращивают на пластинках и культивируют. Они представляют собой требуемые трансформанты Е.coli K12 BE783/pL0314 и

E.coli К12 BE783/pL0315. Трансформанты используют для последующего 4р выделения плазмид pL0314 и pL0315.

В результате получают рекомбинантные плазмиды двух ориентаций, потому что ДНК-фрагменты связываются в любом направлении. 45

Требуемые плазмиды легко различить и идентифицировать с помощью традиционных рестрикционного ферментативного и гель-электрофорезного анализа.

Рестрикционный участок и функциональ-5Р ная карта каждой из плазмид pL0314 и pL0315 представлены на фиг.9.

Добавление Bgl II связующих к

Sac I переваренному окончанию плазмиды рКС257 проводят по известной методике. St Jonhetal 1981, J. N01

Biol. 152:317. Bgl II /d/KAIATKTr/ и другие связующие являются доступными из Коллаборатив Рйсерч Инк.,,1365 Мэн Стрит Вальтам, МА 02154;

Б. Связывание .и трансформация.

Линейную плазмиду рКС257 с Bgl II окончанием связывают с Bgl II переваренной плазмидой pSV5gpt (приготовленной в примере ЗОБ) в соответ ствии с методикой примера ÇOB. Связанную смесь. используют для трансформации в Е.coli К12 ВЕ783 также по методике примера ЗОВ. Полученные в результате трансформанты Е.co i

К12 BE783/pL0316 и Е.coli К12BE783/pL0317 используют для выделения плазмид pL0316 и pL0317. Как и в примере ÇOB, получают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного придающего устойчивость. фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты могут быть легко различны и идентифицированы традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта

Пример 31. Конструирование клеток Мышь Ltk /pL0314. 55

Конструкцию готовят в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиду

174 18

pL0314, а не рКС214. Сконструированные таким образом трансформанты

Мышь Ltk /pLOÇI4 затем выращивают в массовой культуре.

IT р и м е р 32. Конструирование клеток Мышь 1.tk /pL0315.

Конструкцию получают по методике примера. 4, с тем исключением, что используют плазмиду pL0315, а не плазми ду рКС214. Сконструированные таким образом Мышь Ltk /pI.0315 трансформанты затем выращивают в массовой . культуре.

П р-и м е р 33. Конструирование плазмид рЬОЗ16 и pL0317 и трансформанты Е.coli К12 ВЕ783/pL0316 и

Е.cali К12 BE783/pL0317.

А. Sac I-рестрикция плазмиды рКС257 и добавление Bgl II связующих.

Рестрикцию проводят по методике примера 28Б, с тем исключением, что используют Sac I рестрикционный фермент с 10Х реакционной смесью (600 мМ NaCl, 100 мМ трис-НС, рН 7,4, 100 мМ MgC1 ), а не плазмиду pUR222 и Нае II рестрикционный фермен с реакционной смесью.

19 12 плазмид pL0316 и pL0317 представ. лены на фиг.9.

Пример 34 Конструирование клеток Мьппь Ltk /pL0316 и Mans

Ltk /pL0317.

Конструкции, каждую отдельно, гото вят по методике примера 4, с тем искхпочением, что используют плазмиды

pL0316 и pL0317, а не плазмиду рКС214. Сконструированные таким образом трансформанты Кышь Ltk /pL0316 и Мышь Ltk /pL0317 затем отдельно выращивают.в массовой культуре.

Пример 35. Конструирование плазмид pL0318 и pL0319 и трансформанты Е.coli К12 BE783/pL0318 и

Е.coli K12 ВЕ783/pL0319.

Конструкции готовят по методике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС 261, а не плазмиду ðÊÑ257. Трансформанты

Е.coli К12 ВЕ783/pL0318 и Е.coli

К12 ВЕ783/pL0319 используют для выделения плазмид pL0318 и pL0319.

Как и в примере 30В, получают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Плазмиды и полученные трансформанты легко различают и идентифицируют традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид рТ.0318 и pL0319 представлены на фиг.9

Пример 36. Конструирование клеток Мышь Ltk /pL0318 и Мьппь

Ltk /рЬ0319. Конструкции готовят каждую отдельно в соответствии с методикой примера 4, с тем исключением, что используют плазмиды pL0318 и pL0319, а не плазмиду рКС214. Сконструированные таким образом плазмиды Мышь

Ltk /pL0318 и Мыпь Ltk /pL0319 saтем отдельно выращивают в массовой культуре.

Пример 37. Конструирование пл амид р .0320 и pL0321 и трансформанты E.coli K12 BE1041/pL0310 и

Е.со1i К12 ВЕ1041/pL0321.

Конструкции готовят по методике примера 33, с тем исключением, что используют плазмиду рКС275, а не плазмиду рКС257. Полученные трансформанты E.coli К12 ВЕ1041/pL0320 и E.coli К12 ВЕ1041/pL0321 использу ют для выделения плазмид р?.0320 и pL0321. Как и в примере ЗОВ, по20

50174 лучают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Плазмиды и пелученные трансформанты легко различают и идентифицируют традиционными способами. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмид pL0320 и

pL0321 представлены на фиг.9.

Пример 38. Конструирование клеток Мьппь Ltk /р1.0"20 и Мьппь

Ltk /pL032i.

Конструкции готовят каждую отдельно по методике примера 4, с тем исключением, что используют плазмиды р1.0320 и pL0321 а не плазмиду рКС214. Сконструированные таким образом трансформанты Мышь Ltk /pL0320 и Мышь Ltk /pL0321 затем выращивают в массовой культуре.

Пример 39. Конструирование плазмиды рКС273 и трансформант E.coli К12 ВЕ783/рКС273.

А. Конструкция 2ри ига ген"содер4 жащей линейной:ДНК с ВашН I и БаИ окончаниями.

Инкубируют при 37 С в течение 1 ч, а затем 5 мин при 70 С около 5рл

i (5 пг) плазмиды рУЕр24 в ТЕ-буфере,.

5 рл ДТТ, 5 мл (1000 мг/мл) БСА, 25 рл вофы, 5 рл (5 единиц) Bam II рестрикционного фермента и 5рл 10Х реакционной смеси (1500 мМ NaC1, 60 мМ трис-НС1, рН 7,9, 60 мМ МяС1 ).

Охлаждают на льду BamH I переваренную ДНК, осаждают этанолом, а затем растворяют в 30 ил воды, к которой прибавляют 5 фл 10Х указанной реак40 ционной смеси, 5 пл ДТТ, 5 par (1000 мг/мл) БСА и. 5рл (5 единиц)

Sal I рестрикционного фермента. Полученную смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч, затем при 70 С в те45 чение 5 мин и, наконец, охлаждают до 4 С. Затем смесь экстрагируют из фенола и смесью хлороформ — изоаминовый спирт (24:1), после чего осаждают этанолом. Полученный осадок содержит требуемую линейную ДНК. Ее

50 растворяют в 5 рл 5 мМ NaCl и хранят а при 4 С для дальнейшего использования. .Б. Конструкция гена устойчивости к гигромицину В, содержащего линейную ДНК с BamH I u Sal I окончаниями.

Линейную ДНК конструируют по методике примера 39А, с тем исключением, 21 1250 что используют плазмиду рКС259, а не плазмиду УЕр24. Получают осадок, содержащий требуемую линейную ДНК. По- следнюю растворяют в 5 р л 5 MN NaC1 и хранят при 4 С для дальнейшего использования.

В. Связывание и трансформация.

Связывание и трансформацию в Е.coli К12 ВЕ783 проводят по методике примера 28В, с тем исключением, что 1О

I связывают фрагменты ДНК, приготовленные в примерах 39А .и Б, а не .

Нае II фрагменты плазмид pUR222 и рКС261. Их используют в последующих трансформациях. Некоторые из полученных трансформантов, как видно из гель-электрофореза и других тестов содержат требуемую плазмиду. Та- . кой трансформант — Е..coli К12

ВЕ783/рКС273 — отбирают, выращивают 20 на пластине, культивируют и исполь- . зуют для последующего выделения плазмиды рКС273. Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды рКС273 представлена на фиг.10. 25

Пример 40. Конструирование клеток Saccharomyces cerevisiae/рКС273.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae выращивают в смеси 1%-ного дрожжево- 3g

ro экстракта (2X — ный бактопептон) и

1Х-ной глюкозы, используя традиционные микробиологические процедуры.

Трансформацию плазмиды рКС273 в дрожжи проводят по известной методике.

Hinnen et al. 1978, Prnc. Nat. Acad.

Sci. USA 75: 1929. Отбирают трансформанты по их способности к росту в минимальной среде с недостатком урацила (ura фенотип). Ura -трансфор- 40 манты последовательно испытывают на способность к росту в комплексной среде, дополненной 200 мг/мл гигромицина В. Такая доза является леталь-. ной для нетрансформироланных клеток 45

Saccharomyces cerevisiae pKG273.

Трансформантные клетки растут на этих средах, тогда как нетрансформированные Saccharomyces cerevisiae. погибают. 50

Пример 41. Конструирование плазмиды pL0378 и трансформант

Е.coli К12 ВЕ783/pL0378.

А. Pst I рестрикция плазмиды

:p3R322.

Рестрикцию проводят по методике примера 28Б, с тем исключением, что, используют плазмиду рВР322 и Pst Х

174 22 г рестрикционный фермент с 10Х реакционной смесью (500 мМ NaCl, 60 мМ трисНСl, рН 7,4, 60 мММдС1 ),а не плазмиду

pUR222 и Нае II рестрикционный фермент, с ре ак цион ной смесью. Получе нный про-дукт Pst I- переваривания растворяют в 5 мл 5 мМ NaC1

Б. Pst I рестрикция плазмиды рКС264.

Рестрикцию проводят по методике примера 41А, с тем исключением, что используют плазмиду рКС264, а не плазмиду рВР322. Полученный продукт

Pst I-переваривания растворяют в

5 р л 5 мМ NaCl

Г

Б. Связывание и трансформация.

Связывание и трансформацию Е.coli

К12 ВЕ783 проводят по методике рримера 28Б, с тем исключением, что свя- зывают фрагменты ДНК, приготовленные в примерах 41А и Б, а не Нае II фрагменты плазмид pUR222 и рКС261 и используют для последующей трансформации. Некоторые из трансформантов, как показывает антибиотический отбор, гель-электрофорез и другие испытания, содержат требуемую плазмиду. Такой трансформант — Е.coli

К12 ВЕ783/pL0378 — отбирают, выращивают на пластине, культивируют и используют для последующего выделения плазмид pL0378.

Как и в примере ЗОВ, получают плазмиды двух ориентаций, в зависимости от ориентации вставленного, придающего устойчивость фрагмента. Следовательно, в дополнение к плазмиде

pL0378, указанная процедура также генерирует плазмиды с обратной ориен- тацией. Эти плазмиды и полученные трансформанты легко различить и идентифицировать традиционными способами.

Рестрикционный участок и функциональная карта плазмиды pL0378 представлены на фиг. 10.

Пример 42..Конструирование клеток Saccharomyces cerevisiae

pL0378.

Трансформацию проводят по методике примера 40, с тем исключением, что используют плазмиду р1.0378, содержащую ген устойчивости к G418 а не плазмиду рКС273. Трансформанты идентифицируют традиционным скринингом реципиентных клеток дрожжей на нали23 1250174 24 чие плаэмиды ДНК. Таким обраэом, же- cerevisiae pL0378 легко идентифицилаемые трансформанты Sacchb"omyces руются и выделяются.

Таблица 1

Тип клеток

Концентрация антибиотика в культуральной среде, р г/мл

200

400

Е.coli К12

Е.coli К12 ВЕ827/рКС203

Е.coli К12 ВЕ827

Е.cali K12 ВЕ827/рКС214

Е.coli K12 ВЕ827/рКС215

Мьппь Ltk

Мьппь Ltk /рКС214

N/Т***

N/Т

N/Т

N/Ò

N/Т

Мышь Ltk /рКС215

*+ - рост есть;

** — — отсутствие роста, ***Я/Т - испытание не проводилось.

Таблица 2

Концентрации антибиотика в культуральной среде, р г/мл

Тип клеток

75 500

Е.cali К12/рКС203

Мышь Ltk

Мьппь Ltk /рКС214

Мышь Ltk /рКС215

+ N/Т

+, !

250174

1250174

dglll

5ас I

5ас I

Sul 1

meIl

anal)J Ave I 1, PeuI

Его И

/ho I оХ

М

РИ1

1250174 атее

- РаеХ цвг. 7

Рз11, РУо1

Pat 1,Рчи1

Есо МЧ

Р. М1

Есо EI

0R1

Ра31,Рт1

1250174

hammy

Ю/7а я

EeoAV

ps/1 рему гоаб/

АУ

And

Иапо /

err) Ж/ у/ ф / .10

Корректор А.Зимокосов

Подписное

f г

Я

Х

7

8,о4 С257

1рЬ0320(12Я k8)

Ы вл -т ь)

J pl0374(-143A3)

4. рЦ)31Б(™33.5 НЬ) ь. ршт(129НМ

b; рЕЫ1У/1Л5М/

7. р/-0315 (". 34. З Ъ)

gр40Л7(1Я5М) фиг У

Составитель Л.Чибисова

Редактор Н.Егорова Техред Н.Бонкало

Заказ 4341/60 Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, R-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4