Способ получения мономерного альбумина плазмы крови

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

GOLlHAЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

50301 A I (19) (1!) (51)4 А 61 К 35/14 Б

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3786525/28-14 (22) 03.09.84 (46) 15.08.86. Бюл. !1- 30 (71) Институт биологической физики (72) А.В.Ткаченко (53) 612.118.221;612.124(088.8) (56) Therriault D.I. Taylor. g.F:

Bioehem. Biophys Res..Commun, 1|960, v. 3, В 5, р. 560. ($4)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОМЕР НОГО АЛЬБУМИНА ПЛАЗМЫ КРОВИ путем обработки альбумина цистеином в растворе и последующей инкубации в кислой среде, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в раствор дополнительно вводят восстановленный глютатион в концентрации (2-6) ° 10 М и этилендиаминтатраацетат в концентрации 1О -10 М при молярном соотношении альбумина и цистеина 1:5001:200, рН доводят до 2,0-2,5, инкубируют 15-20 мин при 4-7 С, затем рН доводят до 7,4-8,0 и последовательно инкубируют 2-3 ч при 36-38 С и 10-15 мин при 50-52 С.

1250301

ВНИИПИ Заказ 4356/7

Тираж 660 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к экспериментальной биохимии и молекулярной биологии, может быть использовано для химической неферментативной очистки препаратов альбумина плазмы крови в биотехнологи ., экспериментальной и клинической медицине и ветеринарии при получении и применении белковых плазмоэаменителей.

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта за счет дополнительного введения в раствор, которым обрабатывают альбумин, глютатиона и этилендиаминтетраацетата.

Способ заключается в растворении альбумина в смеси, содержащей цистеин в концентрации (1-3) 10 М, восстановленный глютатион в концентрации (2-6) 10 M и ЭДТА в концентрации 10 " -10 М при этом, молярное, соотношение альбумин: цистеин составляет 1:500-1:200, полученный раствор подкисляют до рН 2,0-2,5 и инкубируют в течение 15-20 мин при

4-7 С после чего доводят рН среды до 7,4-8,0 и инкубируют сначала при

36-38 С в течение 2-3 ч, а затем при 50-52 С в течение 10-15 мин.

П р и м е .р 1. 4 мг содержащего примесь жирных кислот человеческого альбумина плазмы крови (Reanal, BHP) растворили в 1 мл 0,03 M цистеина, содержащего 0,06 М восстановленного глютатиона и 10 М ЭДТА.Молярное соотношение белка и цистеина составляет 1:500. С помощью О, 1 М НС1 полученный раствор подкислили ро рН

2,0 и инкубировали при 4 С в течение

15 .мин. Затем в раствор добавляли кристаллический трис-буфер до 7,4.

Раствор инкубировали при 36 С в течение 2 ч. Затем раствор выдерживали о при 50 С в течение 10 мин, После охлаждения инкубационной смеси до комнатной температуры ее разбавляли в

2 раза трис-глициновым буфером (рН 8,3), используемым для электро. дов при электрофорезе. Вертикальный электрофорез проводили в 10Х-ном полиакриламидном геле, используя для этого микроэлектрофоретическую камеру. Фиксацию и окраску фореграм производили спирт — ацетатным раствором кумасси ярко-синего G --250 на 7 -ном растворе уксусной кислоты.

Количественную оценку результатов фореза производили с помощью микро денситометра MK ЗС. Относительное содержание мономерного альбумина составило по результатам микроденситометрии 88+2,2Х.

Пример 2. 4 мг лишенного примеси жирных кислот бычьего альбумина плазмы крови (Pentex, США) раст« ворили в 1 мл 0„02 M цистеина, содержащего 0,04 M восстановленнбго глютатиона и 2 ° 10 "M ЭДТА. Молярное соотношение белка и цистеина 1:300.

С помощью 0,1 М НС1 полученный раст вор подкислили до рН 2,3.Раствор инкубировали при 5 С в течение 17 мин.

Затем в раствор добавили кристаллический трис-буфер до рН 7,6.Раствор инкубировали при 37 C в течение 2,5 ч.

Затем раствор выдерживали при 51 С в течение 12 мин, После охлаждения инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавляли и подвергали электрофорезу так, как указано в примере 1. Содержание мономерного альбумина составило 97+1,8 .

Пример 3. 4 мг лишенного примеси жирных кислот бычьего айьбумина плазмы крови (Pentex, США) растворили в 1 мл 0,01 M цистеина, содержащего 0,02 М восстановленнного глютатиона и 10 4М ЭДТА. Молярное соотношение белка и цистеина 1:200.

С помощью О, 1Н НС1 полученный раствор подкислили до рН 2,5 и инкубировали при 7 С в течение 20 мин. Затем в раствор добавляли кристаллический трис-буфер до рН 8,0.Раствор инкубировали при 38 С в течение

3,0 ч. Затем раствор выдерживали

d при 52 С в течение 15 мин. После охлаждения инкубированной смеси до комнатной температуры ее разбавляли и подвергали электрофорезу, как указано в примере 1. Содержание мономерного альбумина составило 89+

+2,0Х.

Исполльэование предлагаемого способа позволяет повысить относительное содержание мономерного альбумина в конечном белковом препарате до 90-98 относительное содержание мономерного альбумина в конечном продукте при сохранении нативнык свойств альбумина, а также сократить время эксперимента до 2-4 ч.