Способ определения @ -глутамилтранспептидазы

 

Изобретение касается аналитической химии, в частности способа определения f -глутамилтранспептидазы (ГТП), используемой для диагностики заболеваний печени. Для интенсификации процесса используют другое более растворимое замещенное f-глутамил-п-анилида - -глутамил-3-сульфо (или карбокси)-п-аншгад (ГА). Определение ГТП ведут обработкой ГА глицинолицином при добавлении человеческой сьгооротки. Далее определяют изменение оптической плотности (ОП) и скорость образования гидролизованного продукта. По разности ОП в минуту, берут средние значения и рассчитывают показатель энзимной активности. Снижается в два раза продолжительность определения , максимальная концентрация ГА составляет 6-8 ммоль против 2,9. О) (2 сл С«9 4 :л 1C с/1

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК

СЮ (И) g6 4 С 01 0 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ГЗАТЕНТЪГ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 1974541/23-04 (22) 04. 12. 73 (31) Р2259512.6, Р2333798,6 (32) 05.12.72, 03,07 73 (33) DE (46) 23.08. 86. Бюл. Ф 31 (71) Берингер Ианнхайм ГмбХ (DE) (72) Эрих Бернт, Вольфганг Грубер, Эрих Хайд, Фритц Штэлер, Аугуст

Вильхельм Валефельд и Гюнтер

Вайманн (DE) (53) 547.466.07(088.8) (56) Clin. Clum. Acta, 31, 1971, 175-179. . (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ g-ГЛУТЯЧИП ТРАНСПЕПТИДАЗЫ (57) Изобретение касается аналитической химии, в частности способа определения -глутамилтранспептидазы (ГТП), используемой для диагностики заболеваний печени. Для интенсификации процесса используют другое бо лее растворимое замещенное ф -глутамил- и -анилида — g -глутамил-3-сульфо (или карбокси)-> -анилид (ГА). Определение ГТП ведут обработкой ГА глицинолицином при добавлении человеческой сыворотки. Далее определяют изменение оптической плотности (ОП) и скорость образования гидролизованного продукта. По разности ОП в минуту, берут средние значения и рассчитывают показатель энзимной активности. Снижается в два раза продолжительность определения, максимальная концентрация ГА составляет 6-8ммоль против 2,9.

1253439

V 10Î мин Я-й V а Е (мБ/мл) 3

Изобретение относится к усовершествованному способу определения

1-глутамилтранспептидазы, которая используется в клинико-химических лабораториях для диагностики заболеваний печени, »

Цель изобретения — интенсификация процесса.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве суб- 10 страта Т-глутамил-,.3-сульфо-(или карбокси) и -анилида.

Пример 1. Получение $ -ãëóтамил-а-нитроанилид-3-карбоновой кислоты (GLU PA-3-карбоновой кислоты)»15

9,1 г 2-нитро"5-аминобензойной кислоты (50 мг-моль) и 14,2 ангидрида фталоилглутаминовой кислоты (55 мг-моль) растворяют в 50 мл абсолютного диоксана с добавлением 20

13 мл трибутиламина, Реакционную смесь кипятят в течение 2 ч при обратном потоке. После охлаждения в реакционную смесь добавляют 100 2 н. аммиака и извлекают вэбалтыванием вы- 25 делившийся трибутиламин с эфиром.

Водный раствор концентрируют досуха, растворяют в метиловом спирте и с помощью 80%-ного гидраэингидрата устанавливают рН 10. Реакционный

ЗО раствор выдерживают около 20 ч при комнатной температуре. При этом частично выделяется продукт, который затем фильтруют и промывают метиловым спиртом, Метанольный фильтрат кон35 центрируют досуха и растворяют остаточное масло приблизительно в 300 мл дистиллированной воды.

Этот водный раствор хроматорграфируют над колонкой с 100 мл Довекс

4О (Помех) формиатной формой, промывают

ЗОО мл дистиллированной воды, градуируя 2 л воды 0,5 н.раствора карбоната аммония. Элюат собирают 100 мл фракциями и исследуют методом тонкослойной хроматографии в системе бутанол: ледяная уксусная кислота: вода в соотношении 50:15:15 (проявление хроматограмм: в ультрафиолетовом свете синие пятна или после увлажнения нингидрином и последующего нагрева5О коричневые пятна зон,содержащих ами-* . нокислоту).фракции,содержащие продукт глутаминовая кислота - -нитроанилид-3-карбоновая кислота (значение К <

О, 25), собирают и концентрируют в ваку- 55 уме досуха. Оставшийся порошок перемешивают з абсолютном спирте, фильтруют и сушат в вакууме над хлористым кальцием.

Э

Выход 7 r т -глугамил- -нитро--. анилнд-3-карбоновой кислоты, моноаммониевая соль (58% теоретического) . ультрафиолетовый спектр:

= 317 нм, E = 11,7 см/моль/при 317 нм, Пример 2. Применение г -глутамил- -нитроанилид-3-карбоновой кислоты (GLU РА-карбоновой кислоты) для определения -глутамилтранспептидазы (7 - GT} .

При энзиматическом расщеплении высвобождается 2-нитро-5-амннобензойная кислота.

Проведение измерения, В кювету вводят пипеткой I М трис-буфер, 100 мг-моль глицилглицина, рН 8,25-2,8 мл 130 мг-моль GLU PA-3-карбоновой кислоты в указанном буфере 0,2 мл, нагревают до 25 С, определение начинают при добавлении человеческой сыворотки 0,2 мл, смешивают, оптическую плотность отсчитывают при 405 нм, одновременно включают хронометр. Через 1,2 и 3 мин отсчет повторяют.

По разности оптических плотностей в минуту (а(/мин) берут средние значения и вводят его в.расчет.

Расчет ведут следующим образом.

Международная единица U является энзимной активностью, которая при.

25 С переводит 1 ммоль субстрата в шинуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например, сыворотки.

Для расчета энзимной активности на мл (А) используют общую формулу

Коэффициент экстинкции () 3-карбокси-4-иитроаиилина составляет в условиях опыта при 405 нм 9,4 см /

/ммоль. Толщина (с1) слоя кюветы 1 см, объем используемой сыворотки (V)

0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2мл.

Измерение затухания Е осуществляется через промежутки в 1 мин. При этом

А = 6Е(405 нм)/мин х 1702 (мИмл) °

Пример 3. Получение ф-глутамил-4-нитроанилид-3-сульфоновой кислоты»

115 r анилин-,4-нитро-З-сульфоновой кислоты и 150 r ангидрида фталоилглу таминовой кислоты суспенднруют в 2 л абсолютного диметилформамида и затем нагревают на масляной бане до 145 С.

При достижении этой температуры сус3 1253 пензию выдерживают в течение 1 ч при

145 С и затем охлаждают. Осадок от-, Филь прозывают и концентрируют Фильтрат досуха. Маслянистый остаток растворяют в метаноле и устанавливают рН 9 807"ной гидроокисью гидразина, Через 24 ч отсасывают образовавшиеся кристаллы и промывают небольшим количеством метилового спирта. Фильтрат сушат и при охлаждении осторожно 1О разлагают охлажденным ацетоном. Образующийся при этом осадок отсасывают, промывают хорошо ацетоном и растворяют остаток в воде при перемешивании. Нерастворимый в воде остаток 15 отфильтровывают и с помощью аммиака устанавливают рН раствора 7,5. Путем добавления ацетона выкристаллизовывается аммониевая соль -глутамил-4-нитроанилид-3-сульфоновой кислоты.2р

Продукт очень хорошо кристаллизуется в светло-желтые кристаллики. Т.пл.

186-187 С, Максимум поглощения спектра при

290 нм Е = 4,57 см /ммоль. 25

Выход около 115-120 г, причем

15-20 г можно еще получить из кристаллизационного маточного раствора.

Общий выход около 135 г соответствует 70Å теоретического.

Растворимость соединения при комнатной температуре хорошая и достигает около 1607 степени превращения

g-глутамил- -нитроанилида при одинаковых условиях.

Пример 4. Применение 67. U

РА-3-сульфоновой кислоты для определения g -GK .

При энзиматическом расщеплении соединения по предлагаемому способу 40 высвобождается < --нитроанилид-3-сульфоновая кислота.

439 4

>«ждународная единица ll является энзимной активностью, которая при

25 С превращается 1 ммоль субстрата в минуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например сыворотки.

Для расчета энзимных активностей на мл (А) используют общую Формулу

Ч !000

А=- — — — — — - дЕ (мУ/мл) минЕ d Ч

Коэффициент зкстинкции (6 ) n-нитроанилид-3-сульфоновой кислоты в условиях опыта при 405 нм составляет

5,45. см /моль. Толщина (d) слоя кюветы 1 см, объем введенной сыворотки (Ч) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2.

Измерение оптической плотности Я осуществляют через промежутки в 1 мин.

Отсюда получают

А =лЕ(405 нм) /мин х 2936 {мо/мл).

Предлагаемый способ определения

g-глутамилтранспептидазы, предусматривающий использование в качестве субстрата т -глутамин-3-сульфо(или ,карбокси)->-анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют $-глутамил->-нитроанилид, позволяет значительно интенсифицировать процесс. Максимальная скорость реакции достигается при концентрации лишь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодаря его хорошей растворимости. Максимально достигаемая концентрация при использовании известного субстрата составляет 2,9 ммоль, в связи: с очень ограниченной его. растворимостью.

Проведение измерения.

Пипеткой вводят в кювету 0,1 трис-буфер, 150 мг-моль шлицилглицина, 45

:рН 8,5 — 2,8 мл 130 мг-моль GLU РА-3-сульфоновой кислоты в вьппеприве. денном буфере 0,2 мл, нагревают до

25 С, определение начинают добавкой человеческой сыворотки 0,24 мл, паре-Я мешивают, оптическая плотность отсчи-тывается при 405 мн, одновременно включают хронометр. Точно через 1, 2

H 3 NBH IIol3TGPHMT oTcRf- T

По разностям оптических нлотнос- 55 тей в 1 иик (лЕ/мин) находят среднее значение и вводят его в расчеты.

Расчет ведут следующим образом.

В соответствии с изобретением при мспользовании карбоксильного нроиэводного достигают увеличение скорости реакции на 20Х, а в случае производного сульфокислоты в два раза больше скорость; Это значит, что продолжительность определения может быть уменьшена вдвое.

Формула из об рете ния

Способ определения ф -глутамилтранспептицаэы путем обработки saмещенного -глутамил-н-анилида глицилглицином при добавлении челове« ческой сыворотки и измерения скорости образования гидролизованного продук1? ->34 19

Составитель Л. Иофффе

Техред H.Kàäàð Корректор С. Черни Редактор О. Головач

Заказ 4634/60

Тираж 778

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 та,отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, в качестве замещенного -глутамил— -анилида используют — глута— мил-3- сульфо (или карбокси ) — -анилид.

Ь

11рпорптг т по признакам:

05.12.7;! исходный прслукт

-глутамил-3-карбокси- -анилид.

03,07. 73 исходный продукт — глутамин-3- сульфа- o — .анилид.