Способ определения гидрофобных соединений в биологических жидкостях

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (51) 4 G 01 N 33/48, 33/50

/!1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3671200/28-14 (22) 08.12.83 (46) 30.01.86.Бюл,р 4 (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений. (72) С.В.Харченко, Н.С.Eгоров, В.К.Пикалов и В.С.Данилов (53) 577.158.54 (088.8) (56) Высоцкий E.Ñ.; Закорукв .В.В., Межевикин В.В., Микробиология, 1981, т.50, с.985-991.. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОФОБНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЯХ путем добавления пробы в среду, содержащую бактериальную люциферазу, флавинмононуклеотид, альдегид и фосфатный буфер с последующей регистрацией снижения люминесценции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, н качестве альдегида используют октаналь в концентрации 10 -5 10 М, в среду инкубации дополнительно вводят восстановленный никотинамидадениндинуклеотид ф -4 в концентрации ) 0 -5 1О М, а люциферазу и флавинмононуклеотид используют в концентрациях 0,020,4 мг/мл и 10 -5 - 10 М соответственно.

1 120851! 2

Изобретение относится к биохимии и медицине и может быть использовано для определения гидрофобных соединений в биологических жидкостях, например, при осуществлении контроля за трансформацией и накоплением в организме человека лекарственных средств по накоплению их в биологических жидкостях.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения.

Пример 1. Сначала получают бактериальную люциферазу следующим образом.

Культуру Photobacterium fischeri

11 - 6 МГУ, растущую на твердой среде следующего состава, вес.7.: морская вода 38, пептон 1; мясо -пептонный бульон 8; агар-агар 2; дистиллированная вода остальное, высеивают в жидкую среду состава,вес.Е:

1 агНРО 0,7; КН РО 0,1; (N Й ),НРО 0,05; У 50< 0,01; пелтон 1; hl аС1 28; дистиллированная вода остальное, рН 7,4; через 11 ч .

200 мл культуры стерильно переносят B ферментер емкостью 10 л с той же самой средой и осуществляют. ферментацию 9 ч при контроле и поддержании постоянным рН среды (7,0 ) и уровня растворенного кислорода (107 от насыщения) при 22 С. По окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 25000 х х 30 мин и разрушают лизисом в калий-натрий — фосфатном буфере

0,02 M рН 7,0 с дитиотрейтолом с помощью Тритон Х-100 в качестве детергента в количестве 0,57 от веса клеток в течение 40 мин при 17 С с о последующей обработкой ультразвуком 22 кГц х 2 мин. (3 = О, 6 А, прибор УД3-1), Буфер добавляют в соотношении 4:1 (объем/вес клеток).

Крупные частицы удаляют центрифугированием при 105 000) х 1 ч. Затем.проводят дробное осаждение белков сульфатом аммония в диапазоне

40-757. от насыщения, Осадок растворяют в 50 мл /Na - фосфатного буфера (состав тот же), наносят на колонку с сефадексом ) -10 для быстрого диализа, затем активную фракцию наносят на колонку с сефадексом -100 для очистки от балласта низко- и высокомолекулярных соеди" нений. Полученный препарат люцифетивной системы, содержащей в

0,02 M калий-натрий-фосфатный буфер, 10 M октаналь, 10 M НАДН, 0,02 мг/мл люциферазы и 10 М ФМН

50 оконечный объем пробы 1 мл, Оценку ингибиторного эффекта проводят как в примере 1.

Результаты анализа действия лекарства приведены в табл.2..

55 Как видно из табл,2, введение этазола приводит к увеличению ингибирования ферментативной люминесцентной системы образцами смешанной

l5 !

40 разы переводят в летучий буфер триэтиламин — НС1 0,01М рН 8,8 а затем лиофилизируют. Окончательный продукт люцифераза имеет степень очистки в 120 раз ло активности с никотинамидадениндинуклеотидом и удельную активность 2,0 10 ! ф квант/с мг белка. Он стабилен при хранении при 0-4 С в течение двух лет.

У пациента производят отбор смешанной слюны и определяют влияние слюны на ферментативную активность.

Измеряют на фотометре интенсивность свечения пробы объемом 1 мл (величина 3» контроль),, которую получают добавлением 0,3 мл воды х 0,7 мл

0,02 M калий-натрий-фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 5 10 M октаналь, 2 " 10 M восстановленный ф нико т Ин амид аде ниндинулке о тид (НАДН), 5 ° 10 М флавинмононуклеотид (ФМН) и 0,1 мг/мл люциферазы, В опытной пробе вместо воды добавляют

0,3 мл смешанной слюны, величина 3, опыт . Пациенту вводят аминопирин в дозе 0,15 мг/кг веса и через 2,4, 20 и 24 ч измеряют интенсивность свечения, Величину ингибитарного iэффекта оценивают по

3,-3

Формуле х 100Х, о .Данные приведены в табл ° 1, Как видно из табл.1, после приема аминопирина в слюне наблюдается накопление лекарства и увеличивается ингибирующий эффект. 3а степенью утилизации лекарства можно следить по уменьшению величины ингибирования свечения .

Пример 2. У пациента производят отбор смешанной слюны до и после введения 0,5 г/кг веса этазола и измеряют влияние 0,03 мл смешанной слюны на свечение ферментаТаблица1

Показатели

222 285 386 411

420

?,шЧ

7 ингибирования

8 2

Таблица2

Показатели мя, ч я после введения этазола

221

I mV

7, ингибирования

Таблица3

Показатели

932 177 251 326

484 783

48 16

I mV

7 ингибирования

73

SHHHGH Заказ 284/56 Тираж 7?8 Подписное

Филиал ППП "Патент", r.Óèãîðîä, ул.Проектная, 4 .

3 120851 слюны. Из этих данных видна эффективная трансформация лекарственного соединения в организме человека.

Пример 3. У пациента производят отбор смешанной слюны до и после введения 0,5 г этазола и измеряют влияние 0,2 мп смешанной слю1 4 ны на свечение ферментативной системы (конечный объем 1 мп), содержащей 5 . 10 М октаналь, 5 !0 К НАДН, 0,4 мг/мл люциферазы и 5 "!0 М ФМН.

Оценку ингибиторного эффекта проводят как в примере 1.

Результаты анализа действия этазола приведены в табл.3.

109 128 151 202

48 39 28 4