Способ подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям

 

Изобретение относится к способам подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям . Цель изобретения - исключение артефактов препарирования при использовании криоцротекторов широкого спектра действия за счет добавления при фиксации к глутаровому альдегиду криопротектора в концентрации, равной исходной. Эритроциты крови инкубируют с 40%-ным раствором пропилен гликоля . Охлаждают, центрифугируют . Центрифугат заливают 4%-ным раствором гяутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 40%-ный пропиленгликоль. Клетки перемешивают и фиксируют. Затем вают в ряду растворов пропиленгликоля на фосфатном буфере. Эритроциты обезвоживают. Суспензию наносят на предметный столик, подс-ушивают, напыляют в вакууме серебром. Подготовленный препарат исследуют под микроскопом , t табл. т го со . 4:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 01 Я I 28

ГОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ (21 ) 37 75 36 9/28-1 4 (22) 31.07.84 (4б) 30.08.86. Бюл. У 32 (71) Институт проблем криобиологии и криомедицины (72) Б.А. Скорняков и Т,П. Говоруха (53) 537.533.35 (088.8) (54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ

ПРЕПАРАТОВ К МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ИССЛЕДОВАНИЯИ (57) Изобретение относится к способам подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям. Цель изобретения — исключение артефактов препарирования при использовании криопротекторов широкого спектра действия за счет добавления

„,Я0„„1254344 д 1 при фиксации к глутаровому альдегиду криопротектора в концентрации, равной исходной. Эритроциты крови инкубируют с 40Х-ным раствором пропиленгликоля, Охлаждают, центрифугируют. Центрифугат заливают 4й»ным раствором глутарового альдегида на

0,1 М фосфатном буфере, содержащем

407-ный пропиленгликоль. Клетки перемешивают и фиксируют. Затем отмывают в ряду растворов пропиленгликоля на фосфатном буфере. Эритроцити обезвоживают. Суспензию наносят на предметный столик, подсушивают, напыляют в вакууме серебром. ПодготовленнъпЪ препарат исследуют под микроскопом. 1 табл.

1 254 344 г0

Изобретение относится к медицине, а именно к способам подготовки и микроскопическим исследованиям биологических препаратов °

Целью изобретения является исклю;чение артефактов препарирования при использовании криопротекторов широкого спектра действия.

Способ осуществляется следующим образом.

При подготовке биологических объектов к микроскопическим исследова.ниям, осуществляющей их фиксацию в растворе глутарового альдегида отмывку, постфиксацию раствором осмиевой кислоты, обезвоживание и заключение в смольь, причем, фиксацию осуществляют раствором глутарового альдегида, содержащим исследуемое вещество в концентрации,равной его концентрации в фиксируемом объекте, затем производят отмывку в ряду растворов исследуемого вещества на Фосфатном буфере, концентра цию которого ступенчато уменьшают до О.

Пример 1. Эритроциты крови„ инкубируемые с 401-ным раствором пропиленгликоля, охлаждали до ОМ"С, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, сливалй надосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом Фиксирующего 4Е-ного раствора — глутарового альдегида на 0,1 И

Фосфатом буфере, содержащем 407 пронилен гликоля, рН 7, 3; 300 мосмоль/кг по буферу. Клетки суспендировали в растворе неремешиванием и фиксиро-вали в течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов пропиленгликоля на 0>1 N фосфатном буфере нисходящей концентрации от 40 до 07, при изменении концентрации в каждом последующем растворе на 10Х. Эритроциты, переведенные таким образом в чистый Фосфатный буфер, обезвоживали в ряду растворов ацетона восходящей концентрации (50, 75 и 1ООЖ), после чего суспензию наносили на предметный столик, подсушивали и напыляли в вакууме серебром, ПодготовФ ленный препарат исследовали в растров ом зле ктрон ном микр ос ко пе .

После обработки предлагаемым спо.собом изменения объема и формы по данньи светооп1 (есной микроскопии не отмечалось. В растровом электронном микроскопе эритроциты имели форму шиповидного эллипсоида, что

1 соответствовало предлагаемой реакции

"..ðèòðîöèòîâ на действие высокой концентрации пропиленгликоля.

H p и м е р 2. Эритроциты крови человека, инкубируемые с 6ОЕ HbIH раствором пропиленгликоля, охлаждали до О+4 С, центрифугировали при

3000 об/мин в течение 5 мин, сливали надосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом Фиксирующего

47.-ного раствора глутарового альдегида на 0,1 И Фосфатом буфере, содержащем 607 пропиленгликоля, имеющем рН 7,3 и 300 мосмоль/кг по буферу, клетки суспендировали в растворе перемешиванием и фиксировали в течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов пропиленгликоля на

0,1 М фосфатном буфере нисходящей концентрации (60, 50, 40, 30, 20, 10 и GX). Эритроциты, переведенные в чистый фосфатный буфер, обезвоживали в ряду растворов ацетона 50, 75 и 100Х, после чего суспензию наносили на предметный столик, подсушивали и напыляли в вакууме серебром.

Подготовленный препарат исследовали в растровом электронном микроскопе.

После обработки предлагаемым способом изменений объема и формы эритроцитов по данным светоопти еской микроскопии не отмечалось. Б растровом электронном микроскопе эритроциты имели форму шиповидного эллипсоида со складчатой поверхностью мембран отдельных клеток.

Пример 3. Клетки костного мозга, инкубируемые с 157-ным раствором полиэтиленоксида молекулярной массы 400 (ПЗО-400) охлаждали до 0+4 С, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, сливали надосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом фиксирующего раствора—

4Х-ным глутаровым альдегидом на

0,1 М фосфатном буфере, содержащем

15Х-иый раствор ПЗΠ†4, PH 7,3, 300 мосмоль/кг по буферу, клетки суспендировали в растворе перемешиванием и фиксировали в течение 1 ч, затем отмывали в ряду растворов

ПЗО-400 на 0,1 И фосфатном буфере нисходящей концентрации: 15, 10, 5 и ОХ, Отмытые клетки постфиксировали в 17-ном растворе осмиевой кислоты

9 обезвоживали в ряду растворов ацетона восходящей концентрации (50, 75, 1 254344

После инкубации с криопротектором по способу

Исходное состояние рототип Предлагаемый

0,00+0,005 О, 05 -0,004

Р +0,05

0,01+0,004

Формула иэ обретения

Составитель А. Лычкова

Техред Ч.Моргентал Корректор А. Обручар

Редактор А. Гулька

Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4712/4б

Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4

100 .) и заключали в эпонаралдитовую смесь.

После обработки клеток предлагаемым способом более 903 срезов клеток имели состояние, близкое к нативному. Срезы клеток, претерпевшие изменения, имели, в осковном, частично просветленный цитозоль,незначительно набухшие каналы эндоплазматической сети. Единичные клетки име- О ли сильно набухшие органеллы и каналы эндоплаэматической сети, расширенное перинуклеарное пространство,, но их количество не отличалось от исходного состояния.

Пример 4. Ткань, щитовидной железы и гипофиэ крысы инкубировали

30 мин с 15 .-ным раствором ДМСО при комнатной температуре. После инкубации фиксировали 2,5Я.-ным глютаральдегидом на фосфатном буфере, содержащем 15 . ДИСО. Дальнейшую подготовку образцов осуществляли в соответствии с прописями использованных способов. Исследования, проведенные на ультратонких срезах в электронной микросхеме ЗВМ-10ОБВ, показали, что изменение ультраст уктуры состояли в набухании митохондрий и лизосом и в вакуолеобразном расширении эндоппазматической сети, выраженность которых была незначительной.

Пример 5. Спермии карпа инкубируют 15 мин в 15 .-ном растворе Д4СО, после инкубации суспензию центрифугировали„ снимали надасадок и фиксировали центрифугат 2,5 -ным глютаральдегидом на фосфатном буфе- 4О ре, содержащем 15 ДМСО, фиксатор добавляли к центркфугату в пятикратном объеме и выдерживали 1 ч при

+4 С. Исследования в светооптическом микроскопе показали наличие лишь 45 единичных клеток в поле зрения (кон-центрация клеток в 1 мл суспекзни около 4 10 ) с разрушенными мембранами, зкачительная часть клеток (больше половины в поле зрения) выглядели иктактными меньшая часть— слабонабухшими.

Предложенный способ позволяет устранить артефакты препарирования биологических препаратов в результате коктакта с различными веществами в произвольной концентрации и сохранить морфологические параметры неизменными в течение всего процесса подготовки. Это подтверждают данные таблицы, в которой представлен средний объем митохондрий.

Способ подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям путем их фиксации в глутаровом альдеггде с добавлением ком" пенскрующего осмотическое давление вещества, отличающийся тем, что, с целью исключения артефактов препарирования при исполь-зовании криопротекторов широкого спектра действия, при фиксации к глутаравому альдегиду добавляют в качестве компенсирующего вещества криопратектор в концентрации, равной исходной.