Питательная среда для культивирования пневмококков

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬ-ТИВИРОВАНИЯ ПНЕВМОКОККОВ, содержащая питательную основу, агар-агар, хлористый натрий и дистиллированную воду , отличающаяся тем. что, с целью повышения выхода биомассы пневмококка в капсульной форме, она дополнительно содержит -цистин, экстракт кормовых дрожжей и сахарозу-, в качестве питательной основы она содержит гидролизат плаценты человека при следующем соотношении компонентов , г/л: Гидролизат плаценты человека с сухим остатком 6,3-7,4%20,4-27,2 , Агар-агар 14,0-16,0 Хлористый натрий 3,5-4,2 Е-Цистин 0,038-0,05 а 9 Экстракт кормовых (Л дрожжей2,,5 Сахароза9,0-11,0 Дистиллированная водаДо 1 л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (l9) (И) (5D 4 С 12 И 1 20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3771997/28-14 (22) 18.07.84 (46) 07.10.86. Бюл. Н - 37 (71) Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (72) А.Л. Винник, А.К. Варгина и З.И. Ершова

{53) 576.8.093.1(088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования./Под ред. M.O. Биргера, М.: Медицина, 1982, с. 67.

The 0xoid, Manual, изд. 4, 1981, с. 66-67. (54)(57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬ.ТИВИРОВАНИЯ IIHFBMOKOKKOB, содержащая питательную основу, агар-агар, хлористый натрий и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения выхода биомассы пневмококка в капсульной форме, она дополнительно содержит И-цистин, экстракт кормовых дрожжей и сахарову, в качестве питательной основы она содержит гидролизат плаценты человека при следующем соотношении компонентов, г/л:

Гидролизат плаценты человека с сухим остатком

6,3-7,4Х 20,4-27,2

Агар-агар l4,0-16,0 ллористый натрий 3,5-4,2

Г-Цистин 0,038-0,05

Экстракт кормовых дрожжей 2,8-3 5

Сахароза 9,0-11 0

Дистиллированная вода До 1 л

1261948

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в производстве вакцино-сывороточных препаратов и бактериологической диагностике. 5

Целью изобретения является повышение выхода биомассы пневмококка в капсульной форме за.счет модификации среды, приближающей условия культивирования к естественным в организме человека.

Среду готовят следующим образом.

1 кг свежеэамороженной плаценты режут на кусочки размером 10 — 15 см и помещают в бутыль, в которую предварительно наливают подщелоченную раствором 20Х-ной щелочи NaOH водопроводную воду, затем вносят 100 г панкреатина 45 ЕА единиц активности, хорошо перемешивают и общий объем доводят до 5 л, добавляют 50 мл хлороформа. Бутыль закрывают резиновой пробкой и помещают на 18-20 ч в термостат при 40-43 С. Через 3-4 ч о переваривания коррегируют рН-раствором 20Х-ной щелочи. Через 18-20 ч гидролиэа содержимое бутыли сливают в варочную кастрюлю, подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 4,3-4,6 и кипятят 10 мин. Гидролизат фильтруют через тонкое фильтровальное полотно. В гидролиэате определяют содержание аминного азота (600-700 мгХ) и содержание сухого остатка (6,3-7,4Х).

20

30

50

Навески компонентов вносят в дистиллированную воду в следующей последовательности: гидролиэат плаценты 40 с учетом содержания сухого остатка (при остатке 6,3Х вносят 350 мл т.е.

23,8 г): агар-агар 15 г; f-цистин

0,040 г; экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 3,0 г; хлорид натрия 4,0, г; 45 сахарозу 10 r. Общий объем доводят дистиллированной водой до I л рН готовой среды 7,4-7,6.

Пример- I, Готовят среду ñëéдующего состава, г/л:

Гидролизат плаценты с сухим остатком 6,3Х 20,4

Агар-агар . 14,0

1-Цистин 0,038 55

ЭКД 2,8

Хлористый натрий 3,5

Сахароза 9,0

Дистиллированная вода Цо 1 л

Пример 2 . Готовят среду следующего состава, г/л:

Гидролизат плаценты с содержанием сухого остатка 6,37,4Х 23,8

Агар-агар 15,0

F-Цистин . 0,04

ЭКД 3,0

Хлористый натрий 4,0

Сахароза 10,0

Вода дистиллированная До 1 л

Пример 3. Готовят питательную среду следующего состава, г/л:

Гидролиэат плаценты с содержанием сухого остатка 6,37,4Х 27,2

Агар-агар (высший сорт) l6

0-Цистин 0,05

ЭКД 3,5

Хлористый натрий 4,2

Сахароза 1 I,0

Дистиллированная вода До 1 л

Выход биомассы при выращивании на 3 вариантах среды и посевной дозе 100000 клеток пневмококка на чашку приведен в таблице.

Скорость роста пневмококков на питательной среде 12-18 ч.

Плотная питательная среда на основе гидролиэата плаценты человека беэ добавления сыворотки и крови позволяет получать микробную массу, свободную от балластных веществ.

Приготовленная на сконструированной среде вакцина впервые позволила получить пневмококковые сыворотки со специфическим спектром антител. В серологических реакциях отмечалась одна линия преципитации против специфических полисахаридов пневмококка.

Реакции против других полисахаридов и сыворотки крупного рогатого скота отсутствуют. Титры полученных сывороток имеют значения 1:640-1:1280.

По чувствительности среда на основе гидролизата плаценты человека не уступает контрольным средам, а в отдельных случаях превосходит их.

При посеве 0 05 мл взвеси культуры пневмококка при исходной концентрации 10 ЕД по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича из разведения 2.10

1261948 на .месте нанесения капель отмечается рост единичных колоний пневмококка.

Среда на основе гидролизата плаценты человека позволяет выделять пневмококк из патологического материала.

Пример 4. Выделение пневмококка из мокроты.

Гнойно-слизистый комок мокроты трехкратно отмывают физиологическим to раствором. Затем изготовляют мазок, окрашивают по Граму и подвергают микроскопии для контроля за качеством отмывки и решения вопроса о направлении и объеме последующего 5 культурального исследования. Затем мокроту гомогенизируют. Из. гомогената готовят 6 десятикратных разведений на физиологическом растворе.

Петлей, откалиброванной на 0,01 ил 20 разведения, засевают 7 окружностей с диаметром 25 мм, приготовленных нагретой пробиркой в чашке Петри с кровяным агаром. После 12-18 ч инкубации производят подсчет колоний и 25 идентификацию микробов. Для определения количества бактерий в 1 мл количество колоний в секторе необходимо умножить на 100 и на степень разз ведения. Показатели 10 и менее характерны для сопутствующей микрофлоры, 10 -10 — могут указывать на эти6

6 алогическую роль микроба, 10 и более свидетельствуют в пользу участия

I микроба в патологическом процессе.

С целью создания селективных усло35 вий для выделения определенных микробов посев производят следующим образом.

После предварительной отмывки го40 могенизации и приготовления исходного разведения 1:10 проводят посев исследуемого материала на питательную среду следующим образом: 0,1 мл наносят на чашку Петри и распределяют стеклянным шпателем равномерно по по45 верхности агара. Далее на засеянную исследуемым материалом поверхность агара накладывают 1-2 сапониновых или сапонино-бацитроциновых диска на расстоянии 2 см друг от друга, а на противоположный край — диск с мономицином или гентамицином. Посевы инкубируют в аэробных условиях в о термостате при 36-37 С в течение 1218 ч, либо в атмосфере СО (эксикатор с горящей свечой). Затем учитывают характер роста и морфологию колоний.

На кровяном агаре пневмококки образуют мелкие колонии, полупрозрачные в проходящем свете, с приподнятым краем и центром "блюдце", а К-формы пневмококков — сферические колонии с неровными краями. В атмосфере СО наблюдается более обильный рост. В падающем свете колонии пневмококков имеют зеленовато-серый цвет, более светлый к периферии. Через 20-24 ч и позднее вокруг колоний пневмококка появляется эона альфа-гемолиэа. Последующую идентификацию проводят по общепринятым методикам (окраска и микроскопия, учет морфологии колоний, заражение чувствительных животных, определение чувствительности к оптохину, лиэис культур желчью или оксихалатами, реакция "набухания капсулы, реакция агглютинации с антипневмококковыми сыворотками).

В зоне лизиса, вызванного сапонином, наблюдается пышный рост гемофильных палочек, сапонино-бацитроциновые диски угнетают развитие некоторых грамположительных бактерий и способствуют вьщелению гемофильных палочек, так как создаются локальные селективные условия. Мономицин угнетает развитие стафилококков, грамположительных энтеробактерий, Н.inffuenzae и стрептококков, в то время как циркулирующие в настоящее время штаммы пневмококков не чувствительны к этому антибиотику..

i 261948

Состав среды, г/л

Компоновка среды по ингредиентам

Кровь

ЭКД (-Цистин Сахароза

Гидролизат

Количество

Хлорид натрия плаценты колоний, «1000

20,4 2,8 0,038 9,0

3,5 + 47

40 + 50 — 49

Минимальная

2318 3ю0 Оэ04

10,0

Оптимальная

27,2 3,5 0,05

11,0 4,2 + 52

+ 47

+ 35

Максимальная

Дифко фФ

Агар Хоттингера

+ в среду перед посевом добавлено 5Х крови; — кровь не добавляли.

+ состав среды, r: мозговой экстракт 12;5, экстракт из сердечной мышцы 5, протеоэный пептон 10, глюкоза 2, хлорид натрия 2,5. Na>HP04 2,5.

Составитель Г. Смирнова

Редактор Н. Егорова Техред M.Xîäààè Корректор В. Бутяга

Заказ 5297/19 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по депам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4