Способ определения активности пероксидазы

 

Изобретение относится к биохиMiTO . Цель изобретения - повьппение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата смеси пиротсатехина и резорцина. В кювету спектрофотометра вносят фосфатный буфер, раствор пирокатехина, резорцина и пероксидазы. Реакцию иницируют добавлением 0,03%-ного раствора перекиси водорода. После перемешивания реагентов определяют увеличение оптической плотности. Затем определяют активность фермента. с S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЯМЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 6 01 N 21/78

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

f10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, /3 .

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ПЕРОКСИДАЗЫ . (57) Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения — повышение . чувствительности споооба за счет использования в качестве субстрата смеси пирокатехина и резорцина. В кювету снектрофотометра вносят фосфатный буфер, раствор пирокатехина, резорцина и пероксидазы. Реакцию иницируют добавлением 0,037-ного раствора перекиси водорода. После перемешивания реагентов определяют увиличение оптической плотности. Затем определяют активность фермента. (21) 3827799/28-14 (22) 17.12.84 (46) 07.1 0.86. Бюл. 9 37 (71) Научно;-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете им. А.А.Жданова (72) M.Н.Саксонов, А.Э.Балаян, Т.В.Забелина и Д.И.Стом (53) 612.015.01(088.8) (56) Угарова Н.Н., Попова И.M., Долманова И.Ф., Шеховцева Г.Н. Биохимия, 1980, т.. 45, вып. 12, с. 2243-2253.

„„SU„„1262350 А i

1262350

40

ВНИИПИ Заказ 5418/39 Тираж 778 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения ак-, тивности пероксидазы, и может быть использовано в биологии, токсикологии, медицине.

Цель изобретения — повышение чув— ствительности способа за счет использования в качестве субстрата смеси пирокатехина и резорцина.

Сгособ осуществляется следующим

10 образом.

В кювету спектрофотометра последовательно вносят l мл 0,07 M фосфатного 6y pa рН 7 3 8 0; 1 мл 0 р 04

0,07 M раствора пирокатехина; 1 мл

0,02-0,03 M раствора резорцина;

О, 5 мл раствора, содержащего пероксидазу. Реакцию инициируют добавлением

0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода. После быстрого перемешивания реагентов определяют увеличение оптической плотности при 460 нм.

Активность фермента в условнь|х едиD ницах А = ------, где D — оптичес7 С кая плотность! t — время, мин, E— оптическая толщина кюветы, см, С— концентрация фермента, мг/мл.

Пример 1. Определяют активность пероксидазы фиры "Реанал". В кювету вносят 1 мл фосфатного буфера рН 7,5; 1 мл 50 мМ пирокатехина, мл 25 мМ резорцина: 0,5 мл пероксидазы .(2 мкг/мл в фосфатном буфере); 0,5 мл 0,03%-ного раствора перекиси водорода и измеряют оптичес" кую плотность при 460 нм.

Ь0=062; =! см; =1 мин9

С = 0 25 10 мг/мл, А == а D/t 7 С =

2480 усл.ед.

Пример 2. Измерение проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что рН = 7,25, концентрация пирокатехина 40 мМ, резорцина 20 MM.

D = 0,57; t = мин.", 1 = 1 см;

С = 0,25 10 мг/мл; А== D/t 1 С =

2280 усл.ед.

Пример 3. Измерение проводят аналогично примеру 2, за исключением того, что рН = 8,00, концентрация пирокатехина 70 мМ, резорцина

30 мМ.

Ы) = 0,55; t = 1 мин; 0 = 1 см;

С = 0,25 10 мг/мл; А = и П/t ° Х С

2200 усл.ед.

Пример 4. Определение активности пероксидазы в злодее канадской.

Навеску элодеи 500 мг сырого веса растирают в фосфатном буфере

0,01 М, рН 7,50, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят до метки центрифугируют в течение 10 мин при

3000 об/мин. Измерения проводят согласно примеру 1, но вместо 0,5 мл раствора пероксидазы в кювету помещают 0 5 мл вытяжки. Во втором варианте навеску элодеи предварительно инкубируют в течение 30 мин в растворе ингибитора пероксидазы — 10 М сульфида натрия, затем злодею отмывают и определяют активность фермента аналогично указанному. Расчет проводят на 1 г/мл сырого веса элодеи.

Активность пероксидазы нативной злодеи, Ь13,= 0,52 + 0,06; t = 1 мин; 1 — 1 см, С = вес/объем = 0,5:8:25

0,0025 г/мл (С вЂ” концентрация растительного материала в кювете).

А = дР

Активность пероксидазы элодеи после обработки ингибитором.

Пг = 0,29 0,04; t = 1 мин;

Р = 1 см; С = 0,025 г/мл; A = ь|) /т ° 7 С = 116 усл.ед.

Формула изобретения

Способ определения активности пероксидазы путем инкубации пробы, со- .. держащей пероксидазу, перекись водорода и окисляемый субстрат, с последующим измерением оптической плотности смеси, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения чувствительности способа, в качестве окисляемого субстрата используют смесь, содержащую 40-70 мМ пирокатехин и 20-30 мМ резорцин, а определение ведут при рН 7,25-8,00.