Способ получения производных пролина или их фармацевтически приемлемых солей

 

I. Способ получения пролииа общей формулы . . Rl-A-S-CH2CHCO-14Q соон где R, - ацильная группа, связанная с Ы -аминогруппой аминокислоты, и выбранная из группы, содержащей циклопропаикарбонильнуго , цшслогексанкарбонильнул или адамантанкарбонилькую группы; А - остаток глицина, саркозина или d- D-аминокислоты и имеет карбонильную группу, которая образу-. ет тиольную сложноэфирную связь с атомом серы; или их фармацевтически приемлемых солей, отличающий, ся тем, что соединение общей формулы Й - А - ОН, где А - остаток глицина, саркозина, или защищенной или незащищенной оСD-аминокислоты; R, имеет указанные значения, в виде смешанного ангидрида кислоты или К ацилимидазолильного производного , подвергают взаимодействию с N-

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСИИХ

РЕСПУБЛИН ся) 4 С 07 D 207/12 ьа !

1 !

К flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21} 3514502/23-04 (62) 3450352/23-04 (22) 25.11.82

{23) 16.06,82 (31) 94002/198! (32) 19.06.81 (33) JP (46) 23.11.86. Бюл. У 43 (7 1) Чугаи Сейяку Кабусики Кайся (JP) (72) Садао Танака, Киенори Куромару, Ясуо Фудзимура, Исао Мацунага, Томояси Иваока, Норико Обатаке, Дэунитиро Аоно, Есикаэу Хинохара, Хидеки

Накано, Масафуми Фукусима, Хироюки

Набата, Каэусиге Сакаи и Сун-Ити

Хата (JP) (53) 547.747.07(088.8) (56) Патент Великобритании.У 2050359р кл. С 07 D 207/16, 1981.

Европейский патент Ф 0009898, кл..С 07 С 103/52, 1980. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ

ПРОЛИНА ИЛИ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМ.

ЛЕМЫХ СОЛЕЙ (57) 1. Способ получения пролина общей формулы

3

R1-А- S-СИ СНСО-N

С00Н где R — ацильная группа, связанная с о(-аминогруппой аминокислоты, и выбранная из группы, содержащей циклопропанкарбонильную, циклогексанкарбонильную или адамантанкарбонильную группы;..ЗАД 1272982 АЗ! с с

1

А — остаток глицина, саркоэина или с — О-аминокислоты и имеет М.— карбонильную группу, которая образу-. ет тиольную сложноэфирную связь с атомом серы; или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что соединение общей формулы

Й вЂ” А — ОН

1 где А — остаток глицина, саркоэина, или защищенной или незащищенной K

D-аминокислоты;

К, имеет указанные значения, в виде смешанного ангидрида кислоты или N-ацилимидазолильного производного, подвергают взаимодействию с !

1-(3-меркапто-2-D-метил-пропаноил)L-пролином формулы сн, 1

КБ — СН2СНСО- N

СООН в среде инертного органического растворителя при температуре от -20 до

+20 С с последующим удалением защитной группы и выделением целевого продукта в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве инертного органического растворителя используют тетрагидрофуран, диоксан или дихлорметан.

1272982

Пример I. Получение Н-эамещенных аминокислот. а) D-Маланин 4,5 г растворяют s

230 йл водного Iн.раствора карбоната натрия при перемешивании, К этому раствору по каплям добавляют 100 мл тетрагидрофурана, содержащего 9,0 г циклогексанкарбойилхлорида при 5—

10 С, при этой температуре смесь перемешивают в течение 30 мин, затем перемешивают при комнатной темпера.туре в течение I 5 ч. После этого к реакционной смеси добавляют 2н..раствор HCf для доведения значения рН смеси между 1 и 2. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом, органический слой промывают насыщенным раствором НаС1 и высушивают над сульфатом магния. Фильтрат выпаривают в вакууме, получая неочищенный продукт.

При перекристаллизации его из смеси этилацетат/и-гексан получают 4,65 г

N-циклогексанкарбоиил-D-алании. (а1 - +26,6 . б) Сложный эфир адамантанкарбоновой кислоты и N-оксисукцинамида (3,0 r) растворяют в 30 мл тетрагидИзобретение относится к получению новых производных пролина общей формулы где R — ацильная группа, связанная.

1 с Ф-амнногруппой аминокислоты и выбранная из группы, содержащей циклопропанкарбонильную, циклогексанкарбонильную или адамантанкарбонильную группы1

А - остаток глицина, саркоэина или ol-D-аминокислоты и име. ет ы -карбонильную группу, которая образует тиольную сложноэфирную связь с атомом серы; или их фармацевтически приемлемых солей, обладающих гипотензивйым действием.

Целью изобретения является pasработка на основе известного метода, способа получения новых соединений, обладающих ценными фармакологическими свойствами. роШурана. К этому раствору добавляют 5 мл воды, содержащей 0,89 r Dаланина и I,I r тризтиламина, и смесь перемешивают в течение ночи при 5 С. После удаления тетрагидрофурана к остатку добавляют воду и затем добавляют 2н. раствор HCf для того, чтобы довести значение рН смеси между 1 и 2. Затем смесь обраба16 тывают так å, как в примере Iа, получают 0,38 r Н-адамантанкарбонил-9аланина. (а) = + 11,6 (С 1,0, МеОН).

Соединения, приведенные ниже, приготовлены одним из методов, описанных в примере Ia и б.

Н-Замещенные аминокислоты Метод

N-Адамантанкарбонилглицин б

N-Циклогексанкарбонил-9фенилаланин а

N-Циклогексанкарбоннл-Dлейцин а

Н-Циклсгексанкарбонил-925 триптофан а

Н-Циклогексанкарбонил-Dфенилглицин а

Н-Циклогексанкарбонил-Dметионин а

Н-Циклогексанкарбонил-D © глутамин

Н-Циклопропанкарбонил-Dалании а

Н-Циклогексанкарбонилглицин а

3$ Н-циклогексанкарбонил-. саркозин а

N-Циклопропанкарбонилглицин а

Пример 2. Н-(3-(N-Циклогек+ санкарбонил-9""аланилтио) -2-9-метил» пропаионл )-L-пролин..

Растворяют в 80 мл сухого тетра-. гидрофураиа 5,98 г Н-циклогексанкар.— бонил-D-аланина. К раствору добавляют 5,84 г карбонилдинмидаэола при

-18 C при перемешивании и охлаждении смеси льдом. При этой температуре смесь перемешивают в течение 1 ч и затем к смеси добавляют 6,29 r Н-(3" © меркапто-2 "D-метилпропаноил)-Ь-пролина с последующим перемешиванием при -18 С в течение 30 мин, затеи при комнатной температуре в течение ч. После завершения реакции смесь выпаривают в вакууме, удаляя раство ритель. К остатку добавляют 50 мл воды и к смеси добавляют 2н. соляную кислоту, чтобы установить значение

1272982 рН между 1 и 2 Смесь кстрагируют этилацетатом, и этилацетатный слой промывают насыщенным раствором NaC1, высушивают над сульфатом магния и выпаривают в вакууме. К остатку добавляют 120 мл ацетонитрила и затем добавляют 6 мл дициклогексиламина (ДЦГА}. Смесь перемешивают l ч при комнатной температуре. После выдер!

О живания B течение ночи осадок отфильтровывают и высушивают на воздухе, получая неочищенную соль ДЦГА (12,35 r) . Неочищенную соль суспендируют в 300 мл ацетонитрила, и суспензию кипятят с обратным холодиль15 ником в течение 30 мин. После охлаждения осадок собирают путем отстаивания и высушивают на воздухе, получая 12,20 r белой соли ДЦГА. Соль

ДЦГА (12,2 г) суспендируют в 90 мл зтилацетата, к суспензии добавляют

60 мл 0,5 н.водного раствора бисульфата калия, смесь встряхивают. Орга" нический слой промывают дистиллиро25 ванной водой, высушивают над сульфатом магния и выпаривают в вакууме, получая резиноподобное вещество (8,64 г). Методами ЯМР и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество идентично предлагаемому

30 соединению,.

Пример 3. N-ГЗ-(N-Циклогексанкарбонилглицилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролин. 35

Растворяют в 10 мл сухого тетрагидрофурана 1,02 r N-циклогексанкарбонилглицина. К раствору добавляют

20 мл сухого тетрагидрофурана, содержащего 1,07 r карбонилдиимидазола при -20 С и перемешивании с охлаждением смеси льдом. Смесь перемешивают при этой температуре в течение 1 ч и затем добавляют 6 мл сухого тетрагидрофурана, содержащего 1,09 r N-(3 S меркапто-2-D-метилпропаноил)-L-пролина с последующим перемешиванием при

-20 С в течение 30 мин, затем при комнатной температуре в течение 1 ч. осле завершения реакции смесь выла- >О ривают в вакууме для того, 4тобы удалить растворитель. Остаток подвергают хроматографической очистке на колонке с силикагелем (2x35 см), используя в качестве элюента смесь ме- зэ танола и хлороформа (от 1:100 до

3:100). Фракции, содержащие. конечный продукт, объединяют и выпаривают в вакууме, получая резиноподобное вещество (1,16 r) Методами ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество идентично предлагаемому соединению.

Пример 4. N-13-(N-Цнклопропанкарбонил-0- аланилтио) -2-D-метилпропаноил j-L-пролин, Растворяют в !4 мл сухого тетрагидрофурана 635 мг N-циклопропанкарбонил-D-аланина и 0,70 мл триэтиламина. К этому раствору добавляют

0,48 мл этилхлорформиата при — 15 С при перемешивании и охлаждении смеси льдом. Смесь перемешивают при этой температуре в течение 15 мин и после этого добавляют 1,09 г Н-(3меркапто-2-D-метилпропаноил)-1 -пролина и 10 мп сухого тетрагидрофурана, содержащего 0,70 мл тризтиламина с последующим перемешиванием при

-15 C в течение 15 мин, затем при

5 С в течение ночи. После завершения реакции, смесь выпаривают в вакууме при 30-35 С для того, чтобы удалить растворитель. К остатку добавляют

l0 мл воды, и к смеси добавляют 2н. соляную кислоту для доведения значе" ния рН между 1 и 2. Смесь экстрагируют хлороформом, и хлороформовый слой промывают насыщенным раствором

NaCI, высушивают над сульфатом магния и выпаривают в вакууме. Остаток подвергают хроматографической очистке .на колонке с силикагелем (2 х х 35 см), используя в качестве элюента смесь метанола и хлороформа (от

1:100 до 3:100). Фракции, содержащие конечный продукт, объединяют и выпаривают в вакууме, получая 395 мг резиноподобного вещества. Методами

ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещест" во идентично предлагаемому соединению.

Пример 5. N-(3-(N-Циклогексанкарбонил-11-метилглицилтио)-2-D метилпропаноил)-L-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что N-циклогексанкарбонилглицин заменяют íà N-циклогексанкарбонил-И-метилглицин (1,09 r), карбонилдиимидазол {1,09 г) и N-(3меркапто-2-D-метилпропаноил) L-пролин (1,09 r). Получают 0,76 г резино. подобного вещества. Методами ЯМР-анализа и тоикослойной хроматографии!

272982

5 установлено, что это вещество идентично предлагаемому соединению.

Пример 6. К"(3-(N-Циклопропанкарбоннлглицилтио)-2-0-метилпропаноил)-Т -пролин.

Повторяют методику примера с

/ тем исключением, что N-циклогексанкарбонилглицин заменяют на И-циклопропанкарбонилглицин (0,96 г), кар16 бонилдиимидаэол (1,09 г} и К- (3-меркапто-2-D-метилпропаноил)-L-пролин (1,09 г) . Получают 0,4 г реэиноподобного вещества. Методами ЯМР=анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещества идентично предлагаемому соединению.

Пример 7. N-(3-(N-Адамантанкарбонилглицилтио)-2-9-метилпропаноил)-L-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что К-циклогексанкарбонилглицин заменяют на К-адамантанкарбонилглицин (! 42 г), карбонилдиимидазол (1,09 г) и N-(3-меркапто-2-0-метилпроланоил)-L-пролин (1,09 r). Получают 1,7 г резиноподоб ного вещества. Методами ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество идентично предлагаемому соединению.

Пример 8. N-(3-(N-Циклогексанкарбонил-D-фенилаланилтио)-2-9метилпропаноил)-Ь-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что К-циклогексан35 карбонилглицин заменяют на К-циклогексанкарбонил-D-фенилаланин (1,54 г) карбонилдиимидазол (1,09 г) и N-3меркапто-2-D-метилпропаноил)--.Ь-про46 лин (1,09 г}. Получают 0,97 г реэнноподобного вещества. Методами ЯМРанализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество идентично предлагаемому соединению.

П р и.м е р 9. К-(Э-(N-циклогексанкарбонил-D-лейцилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что N-циклогексанкарбо нилглицин заменяют на К-цнклогексан50 карбонил-D-лейцин (1,20 г) „ карбонилдиимидаэол (0,97 г) и К-(3-меркапто-2-D-метилпропанонл)-L-пролин (0,98 г). Получают 1,17 г реэинопоА добного вещества. Методами ЯМР-ана- лиза и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество идентично предлагаемому соединенкю, f)

Пример IO., N-(3-(N-Циклогек" санкарбоннл-D-триптофилтио)-2-D-метилпропаноил )-L-ïðîëèí.

Повторякт методику примера 4 с тем исключением, что N-цнклогексанкарбонилглицин заменяют на N-циклогексанкарбонил-D- pvnwo@ae (I,75 г), карбонилдиимидаэол (I 09 r) и К-(3меркапто-2-D-метилпропаноил)-L-пролин (1,09 г) . Получают 0,8 г реэиноподобного вещества. Методами ЯМР-ана" лиза и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество аналогично предлагаемому соединению.

Пример t l. К-(3-(К-Циклогексанкарбонил-0-феннлглицилтио)-2-D-метилпропаноил )-L-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что N-циклогексанкарбонилглицнн заменяют на К-цикяогексанкарбонил-D — фенилглицин (1,30 r), карбонилдиимндазол (0,97 г) и N-,(3меркацто-2-В-метилпропаноил)-L-пролин (0,98 г). Получают 0,35 г реэиноподобного вещества. Методами ЯМР-анализа н тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество аналогично предлагаемому соединению.

П р н м е р 12. N-(3-(N-Циклогексанкарбонил-D-метионилтио)-2-D-метилпропаноил j-L-пролин.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что Кгциклогексанкарбонилглицин заменяют íà N циклогексанкарбонил- метионин (l,30 г), карбонилдинмидаэол (1,09 r) н К-(3-меркапто-2-D-метилпропаноил)—

L-пролин (1,09 r) . Получают 0,59 r реэиноподобного вещества. Методами

ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество аналогично предлагаемому соединению.

П р и и е р 13. К-(3-(N-Циклогексанкарбонил-В-глутамннилтио)-2-D-иетилпропаноил 1-L-пролив.

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что N-циклогексанкарбонилглицин заменяют на К-циклогексанкарбонилглутамин (0,5 г), карбонилдиимидазол (0,41 г) и N-(Э-меркапто-2-D-метилпропаноил)-L-пролин (0,41 r). Получают 0,3 г резиноподобного вещества, методами ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество аналогично предлагаемому соединению.

1272982 (10 мл) и перемешивают при -15 C н течение 20 мин, а затем при 5 С н те-чение ночи. Реакционную смесь упяринают при пониженном давлении, к остатку добавляют наду. После доведения рН до 4 с помощью 3 н.HCI про- . — ) изводят зкстракцию хлороформом, Хлороформный слой промывают дняжды насыщенным водным раствором хлористого натрия, сушат над сульфатом магния и упаринают при пониженном давлении для удаления растворителя ° Остаток подвергают хроматографии на колонке с силикагелем с использованием

<5 колонки размером 2,5х50 см, и фракции, содержащие продукт, собирают и упаривают при пониженном давлении, давая 320 мг Н- 13-{циклопропанкарбонил-D-аланилтио)-2-D-метилпропаноил1—

20 L-пролина в ниде камедеообразного вещестна.

Пример 17. Из N-(Э-(N-циклогексанкарбонил-D-аланилтио)2-D-метилпропаноил 1-L-пролина образуются различные соли: а) Кальциевая соль.

Растворяют в 40 мл метанола образец (3,98 г} соединения, приготовлен.ного в примере 3. К этому раствору

30 добавляют 0,84 r гидрата ацетата кальция, смесь кипятят с обратным холодильником в течение ч. Нерастворимое вещество. отфильтровывают, филь трат выпаривают в вакууме. К остатку добавляют хлороформ, смесь отфильтровывают и .выпаривают в вакууме. К остатку добавляют диэтиловый эфир и смесь фильтруют и высушивают на воздухе, получая кальциевую соль соедине0 ния примера Э (3,40 г) (а1 = -47,2 (С = 1,0, МеОН). б) Магниевая соль.

П р и и е р 14. N-(3-(N-адамянt танкарбонил-D аланилтио) -2-D-ìå Twëпропаноил j-1:-пролин °

Повторяют методику примера 4 с тем исключением, что N-циклогексанкарбонилглицин заменяют íà N-адамантанкарбонил-D-алании {1,2 г), карбонилдиимидазол (0,97 r) и N-(3-меркапто -2-D-метилпропаноил)-L-пролин (0,98 г). Получают 1,02 г резиноподобного вещества. Методами ЯМР-анализа и тонкослойной хроматографии установлено, что это вещество аналогично предлагаемому соединению.

Пример 15 (пример, использующий М,Н-тионилимидазол).

Тионилхлорид (5,79 г) добавляют к сухому дихлорметану (80 мл) и охлаждают до -15 С при перемешивании.

К раствору добавляют N-триметилсилилимидазол (15 r), и раствор перемешивают при -13 С в течение 1 ч, а затем добавляют N-циклогексанкарбонилD-алании (8,8 r) и перемешинание производят при той же температуре в течение 30 мин.. После добавления к сме. си 3-меркапто-2-D-метилпропаноил-1.— пролина (9,5 г) и перемешивания ее в течение l ч величину рН смеси доводят до I с.помощью 3 н.НС 1, органический слой отделяют и промывают дважды насыщенным водным раствором .

НаС?, сушат над сульфатом магния и упаривают при пониженном давлении для удаления дихлорметана. Остаток подвергают хроматографии на колонке с силикагелем (колонка размером 2,5х

x50 cM) и фракции, содержащие целевое соединение, собирают, объединяют и упаривают при пониженном давлении, давая 12,5 г М-(3-(циклогексанкарбонил-D-аланилтио)-2-D-метилпропано- йл)-L-пролина в виде бесцветного твердого вещества типа жженого са хара. 45

Пример 16 (пример, использующий пивалоилхлорид в качестве смешанного ангидрида кислоты).

К раствору N-циклопропанкарбонилD-аланина (635 мг) и триэтиламина (0,70 мл) в сухом диоксане (14 мл) добавляют пивалоилхлорид (0,35 мл}, и раствор охлаждают до †)5 С при перемешивании. Перемешинание продолжают в течение 15 мин; к смеси добавляют раствор N-(3-меркапто-2-D-метил. пропаноил)-L-пролина (1,09 r) и триэтиламина (0,70 мл) в сухом диоксане

Повторяют методику а, используя

3,09 г соединения, приготовленного в примере 3 или 5, и 0,722 r тетрагидрата ацетата магния. Получают

2,42 г магниевой соли соединения из примера 31а3, = -46,6 (C I,O, ИеОН). в) Лизиновая соль.

Растворяют в 22 ип метанола 1,19 г соединения, приготовленного в приме- . ре 3. К этому раствору добавляют

0,416 r лизина, смесь перемешивают

1 ч при комнатной температуре и вы-паривают в вакууме. К остатку добав1 яют хлороформ, смесь фильтруют и ныпаривают в вакууме. К остатку добав1272982

10 ляют диметиловый эфир, продукт фильтруют с отсасыванием, получая лизиновую соль соединения примера 3 (1 „54 r), (л) -23,1 (С = I,О, МеОН) °

r) Натриевая соль, 5

Растворяют в 25 мл метанола, образец (2,27 г) соединения, приготовленного в примере 3 ° К этому раствору добавляют 0,514 r ацетата натрия, смесь перемешивают при комнатной тем- 10 пературе в .течение 30 мин, и выпаривают в вакууме. К остатку добавляют

200 мл смеси метанола и хлороформа (3:100 по объему), образовавшуюся смесь фильтруют и выпаривают в ваку- t5 уме. Остаток растворяют в метаноле, раствор фильтруют и выпаривают в вакууме. К остатку добавляют этилацетат, продукт отфильтровывают с отсасыванием, получая натриевую соль сое-20 динения примера 3 (1,85 г) .(а1

= -26,7 (Cl О МеОН). д) Соль дициклогексиламина.

Растворяют в 120 мл ацетоиитрила

13,1 г образца соединения из примера 3. К этому раствору при леремешивании добавляют 6 мп дициклогексиламина. Смесь дополнительно перемешивают в течение 30 мин, затем оставляют на ночь. Остаток отфильтровывают с отсасыванием и высушивают на воздухе. Образовавшиеся неочищенные кристаллы суспендируют в 300 мл ацетонитрила, суспенэию кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин.. 35

Суспенэию охлаждают, кристаллы отфильтровывают при отсасывании и высушивают на воздухе, получая дициклогексйламинную соль соединения примера 3 (12,2 г) . (a) = - 24,5 (С 40

=.I О, МеОН).

Полученные производные пролина и их фармацевтически приемлемые соли предохраняют образование ангиотенэияа II иэ ангиотензина I путем ингиби-4э рования активности фермента, превра" щающего ангиотензин. Поэтому они полезны для снижения повышенного давления, вызванного ангиотензином II,, и в качестве агентов для лечения сер->0 дечной недостаточности.

Выла измерена активность некоторых иэ полученных соединений в отношении ингибирования фермента, превращающего ангиотензин.

l. Метод.

Фермент, превращающий ангиотензин, был экстрагирован иэ ле1 ких кролика.

2. Резульгаты даны в табл. l.

Таблица 1

Испытуемое соединение

Iso

1, бх10

4,8х!О

1,3x)0

4,0х10

1,8х10

2,4xjo 1,0х10

1,5х10 7

1, 7х10

В пробирку помещают 0,6 мл буферного раствора (рН 8,3) 0,11 1М борная кислота — карбонат натрия,. 0,02 мл

0,11 1-молярного раствора буфера борная кислота — карбонат натрия (рН

8,3), содержащего 25 ммоль/л бензоилглицилгистидиллейцина субстрат и

0,1 мл О,111-молярного раствора буфера борная кислота — карбонат натрия (рН 8,3), содержащего от 10 до э

10 моль/л испытуемых соединений (13 конечных продуктов указаны в табл.l) и предварительно культивируют при

3? С в течение 5-10 мин. Затем добавляют в каждую пробирку 0,1 мп раствора фермента (порошок в ацетоне), и каждую смесь культивируют 30 мии при 37 С. Бензоилглиции, получакя ийся с помощью фермента, экстрагируют этилацетатом в присутствии хлористоводородной кислоты и определяют его количество по УФ-пошлощению при

228 нм. Определяют активность фермента в присутствии испытуемых соединений относительно активности в отсутствие испытуемых соединений, при нятой за 100. Концентрацию каждого испытуемого соединения, при которой относительная активность фермента составляет 50Х называют активностью каждого испытуемого соединения в отношении ингибирования активности фер- мента и ее обозначают величиной 1

1272982

Иетодика испытаний.

1) Ферментативный гидролиз ин витро. ип 5Х-ного гомогената печени крысы в 0,1 И калийфосфатного буфера (pH 7) смешали с 1 мл 10 И раст1 вора испытываемого соединения в том же самом фосфатном буфере, после че" го смесь ннкубировали при 37 С в те"

1О чение заданного промежутка времени, указанного в табл.2. К 100 мкл такой смеси добавили 6 капель н.соляной кислоты и 5 мл этилацетата. После ме". ханического перемешивания в течение

5 10 мин смеси подвергли центрнфугиро" ванию, а полученный этилацетатный слой отделили и выпарили. Остаток растворили в 1 мл воды и к водному раствору добавили б,5 мкл 0,4 И фосфатного буфера (рН 6,85} и 5 мкл

5 10 И (N-n-(2-бензимидазолил)-фенилмалеимид (БИФИ}, а затем смесь оставили стоять в течение 40 мнн прн

O Ñ.

4,8х10

1,7xlO

5,4х10

4,4xlO

I3

П р и м е ч а н и е. Соединение

1: N-(3-(К-циклогексанкарбонил-Dаланилтио)-2-D-метилпропаноил1-Ь-пролин; 2: N-(3-(N-циклопропанкарбонилD-аланилтио)-2-D-метилпропаноил)-L- . пролин; 3: К-(3-(К-циклогексанкарбонилглицилтио) †.2-D-метилпропаноил)-Lпролин; 4: К-(3-(N-циклогексанкарбонил-N-метилглицилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролин; 5: N-f.3-(N-циклоцропанкарбонилглицилтио)-2-0-метилпропаноил) Ь-пролин; 6: К-! 3-(К-адамантанкарбонкпглицилтио)-2-D-метилпропаноил)-L"ïðîëèí; 7: К-(Э-(N-циклогексанкарбонил-D-фенилаланилтио)-2D-метилпропаноил)-L-пролив; 8: N-(3(К-циклогексанкарбонил-П-лейцилтио)2-D-метилпропаноил)-L-пролин; 9: N(3-(К-циклогексанкарбонил-D-триптофилтио)2-Р-метилпропаноил)-L-пролин; !О: К-(Э-(N-циклогексанкарбонил-D-фенилглицилтио)-2-D-метилпронаноил)-L—

3S пролин; ll: N-(3-(N-циклогексанкарбонил-D-метионилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролин; 12: N-(3"(N"öèêëoãåêсанкарбонил-D-глутаминилтио)-2-D-МетилпропаноилJ-L-пролин; !3: К-(3-(N"

40 адамантанкарбонил-D-аданилтио)-2-Dметкппропаноил)-L-лролин.

Для проведения сравнительного анализа были взяты. следующие соединения .43 предлагаемое - А) К- (3- (N-циклогексанкарбонкп-0-аланилтио)-2-D-метилпропаноил1-Ь-пролин; известные — В)

К-!.3-(N-ацетил-L"ïðîëèëòèî)-2-D-метил пропаноил)-L-пролин; С) К-(2-(N-аце- $0 тил-L-фенилаланкптио}-пропаноил)-Lпролии; D} К-(3-(К-трет.бутилоксикарбонилглицилтно)-2-0-метилпропаноил)L-пролин; Е) N-(3-(К-бензоил-L-фенилаланилтио)-2-D-метклпропаноил)-L -про-5$ .лин; F) N-E3-(К"циклопентанкарбонкп-.

Ь-эланилт1 о)-2-D-метилпропаиоил)-Lпролин., Подсчет уменьшения количества

БИФИ производили путем возбуждения пробы при 310 нм и измерения излуче-.. .ния при 365 нм (предел измерения: более 0,1 мкг 3-меркапто-2-D-метилпропаноил-L-пролина).

2) Ингибирование сосудосужающей . реакции на ангиотензин Е.

Испытываемое соединение вводили в организм через рот в дозировках

0,4 мкмоль/кг веса животного (крйсы), подвергнутого анестезии, а спустя заданный промежуток времени после введения в организм подопытным животным ,внутривенно вводили ангиотензин 1 в . дозировке 300 мг/кг, после чего наблюдали ингибирование сосудосуживающей реакции на ангиотензин I.

В качестве испытываемых соединений использовали соединения А, В и

С, которые были теми же, .что и s ходе осуществления методики испытания 1).

Результаты испытаний приведены в табл.2.

Как проиллюстрировано результатамн испытаний, приведенных в табл.2,. все известные соединения проявляют более высокую чувствительность тиолэфирной связи к ферментативному рн tt (ин витро ) гидролизу, чем предлагаемые соединения.

Известные соединения за исключением соединения В, подвергались фер1272982

Таблица 2

Гидролиэ " H BHtpo (oc таточный процент) Испытываемые соединения

Активность "ин вино"

10 мин 30 мин 60 мин

60 мин 90 мин 120 мин 180 мин п 12

44 56

1 00 98

62 и *4

100 98 п 4

13 23

15

53

" n - -число циклов испытаний.

Составитель И.Бочарова

Редактор С.Льакова Техред Jt.Ñåðäþêoâà Корректор И.Максимишинец

Заказ 6352/58 Тиразк 379 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж"35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г.увгород,ул.Проектная 4 ментативному гидролизу при уровне деструкции свыпе 507 после инкубирования в течение 60 мин с образованием соответствующего количества свободных меркаптогрупп. С другой стороны, хотя соединение В проявляет значительиув стойкость к ферментатинному гндролиэу тиолзфирной группы, оно способно ингибнровать сосудосуживающую реакцию на ангистезин I на уровне только приблизительно 50Х от того уровня, который достигается с использованием предлагаемых соединений.