Штамм бактерий pseudomonas putida в-2950, используемый для очистки сточных вод от алкилфенолэтоксилатов типа оп

 

(19)RU(11)1285776(13)C(51)  МПК ⁵    _{C12N1/20, C02F3/34C12N1/20, C12R1:40}Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина:

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA В-2950, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ АЛКИЛФЕНОЛЭТОКСИЛАТОВ ТИПА ОП

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, являющегося деструктором неиногенных поверхностно-активных веществ, который может быть использован для очистки сточных вод химических и нефтеперерабатывающих заводов. Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего высокой деструктивной активностью по отношению к алкилфенолэтоксилатам типа ОП. Штамм Pseudomonas putida B-2950 выделен методом накопительной культуры из общезаводских сточных вод нефтеперерабатывающего завода им. Кирова (г. Саратов). Указанный штамм депонирован в Центральном Музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ В-2950 и имеет следующие морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки. Морфолого-культуральные признаки. В мазках - грамнегативные палочки, короткие, располагающиеся поодиночке или короткими цепочками, спор и капсул не образуют, подвижные. Прототроф. Имеет хороший рост на простых питательных средах. Оптимум роста 25-30^оС. Растет при 37^оС, но не при 42^оС. На мясопептонном агаре колонии плоские, правильной округлой формы, с приподнятым сосковидным центром. На 3-4 сутки культивирования наблюдается полиморфизм, проявляющийся в образовании колоний с гладкой и морщинистой поверхностью. Обе формы обладают деструктивной активностью. Диаметр колоний после 20 ч роста составляет 1,5-2,5 мм. К концу вторых суток колонии и среда вокруг них приобретают светло-коpичневую окраску, степень которой усиливается по мере увеличения сроков культивирования. Пигмент водорастворимый. На мясопептонном бульоне рост в виде равномерного помутнения, среда окрашивается в коричневый цвет. Растет на SS-агаре, но не в присутствии 6,5% поваренной соли, среде Эндо, кровяном агаре. На среде Книг "В" наблюдается отчетливая флуоресценция. Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Оксидазопозитивен. Образует каталазу. При посеве на OF-среду с 1% глюкозы, мальтозы, этилового спирта - кислотообразование. Последнее отсутствует на OF-среде с ксилозой, рамнозой, сахарозой, арабинозой, лактозой, галактозой, маннитом, дульцитом, инозитом, сорбитом. Не образует индол и сероводород. Не продуцирует лецитиназу, уреазу, дезоксирибонуклеазу, желатиназу и декарбоксилазу лизина и орнитина. Утилизирует цитрат на среде Симмонса. Продуцирует аргинингидролазу. Не вызывает гидролиза крахмала и гемолиза эритроцитов. Выделенный штамм в синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии один ил алкилфенолэтоксилатов, проявляет высокую деструктивную активность. П р и м е р 1. Получение штамма. Микроорганизм - деструктор алкилфенолэтоксилатов выделен методом накопительной культуры из сточных вод нефтеперерабатывающего завода. Материал в количестве 20 мл вносят в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл синтетической среды следующего состава, мг/л: Na₂HPO₄ 6000; KH₂PO₄ 3000; NaCl 500; NH₄Cl 1000; ОП 4-500; pH 7,2. Круглосуточную аэрацию производят с помощью аппарата для встряхивания АВУ - 6 с при частоте 100 колебаний в 1 мин. Через 2, 3, 5 суток из накопительной культуры отбирают пробы, которые высевают на агаризованную синтетическую среду того же состава. Одновременно пробы анализируют на присутствие ОП-4, выделяют чистые культуры бактерий, деструктивную активность которых опять проверяют в жидкой синтетической среде. Количественное определение ОП-4 проводят по колориметрической методике с роданидом аммония при длине волны 434 нм на СФ-26 в кювете толщиной слоя 1 см. Качественное определение способности к деструкции проводят по наличию специфических зон помутнения вокруг колоний деструкторов на агаризованной синтетической среде с ОП-4. Культуры отсевают на скошенный агар и хранят в холодильнике при 4^оС. Идентификацию проводят общепринятым способом на основе морфологических, культуральных, биохимических свойств. П р и м е р 2. Использование штамма в качестве деструктора алкилфенолэтоксилатов. Полученный штамм В-2950 помещают в 500 мл колбу Эрленмейера с жидкой синтетической средой следующего состава мг/л: Na₂PO₄ 6000; KH₂PO₄ 3000; NaCl 500; NH₄Cl 1000; ОП-4 200; pH 7,2. Посевная доза 10⁹ кл/мл. Поверхностно-активное вещество ОП-4 представляет собой алкилфениловый эфир полиэтиленгликоля с 4 моль окиси этилена, т.е. m 3-4. Круглосуточную аэрацию проводят с помощью аппарата для встряхивания АВУ-6 с при частоте 100 колебаний в 1 мин. О способности изучаемого штамма утилизировать ОП-4 и все неиногенные поверхностно-активные вещества (НПАВ) из этой группы с m 6-7 для ОП-7, с m 10-12 для ОП-10 судят по убыли вещества в жидкой синтетической среде с использованием колориметрической методики. По истечении 24 ч культивирования концентрация ОП-4 снизилась на 75% и составила 50 мг/л, через 48 ч вещество исчерпалось полностью. Культивирование штамма в той же синтетической среде и при тех же условиях, но при концентрации ОП-4 500 мг/л дало следующие результаты: через 24 ч снижение его на 71% до концентрации 145 мг/л, через 48 ч - на 87% до концентрации 64 мг/л. Культивирование штамма в синтетической среде такого же состава, но с препаратом ОП-7 (алкилфениловый эфир полиэтиленгликоля, содержащий 7 моль окиси этилена) в качестве единственного источника углерода и энергии, показывает, что при концентрации ОП-7 200 мг/л через 24 ч наблюдается снижение его количества на 39% до концентрации 122 мг/л, через 48 ч - на 71% до 50 мг/л. При исходной концентрации ОП-7 500 мг/л по истечении 24 ч вещество разрушается на 39% и его количество составляет в среде 305 мг/л, через 48 ч - на 68% при конечной концентрации 160 мг/л. При использовании в качестве единственного источника углерода и энергии ОП-10 (алкилфениловый эфир полиэтиленгликоля, содержащий 10 моль окиси этилена) в названной среде и при тех же условиях культивирования получают следующие результаты: при исходной концентрации ОП-10 200 мг/л за 24 ч убыль составляет 65% с остаточным количеством вещества 70 мг/л; через 48 ч ОП-10 разрушается на 75% с конечной концентрацией 50 мг/л. При начальной концентрации 500 мг/л после 24 ч культивирования количество вещества составляет 176 мг/л, что меньше исходного на 65%, через 48 ч остается 115 мг/л, т.е. вещество разрушается на 77%. Кроме того, культура активно деградирует зарубежные аналоги ОП-10: Тритон Х-100 и Тритон Х-305 в названной среде и при тех же условиях культивирования. Тритон Х-100 при исходной концентрации 200 мг/л за 24 ч разрушается полностью. Тритон Х-305 при такой же концентрации, за то же время, разрушается на 75%. Результаты деструктивной деятельности штамма сведены в табл.1. П р и м е р 3. Сравнение деструктивных свойств штамма Ps. putida В-2950 и штамма Ps. fluorescens 5/7. Штамм прототип Ps. fluorescens 5/7 выращивают в колбах Эрленмейера на качалке (1500 об/мин) в синтетической среде следующего состава, мг/л: KH₂PO₄ 700; K₂HPO₄ 300; NH₄NO₃ 200; Тритон Х-100 50; pH 7,5. Через 24 ч культивирования концентрация Тритона Х-100 составила 26 мг/л, т.е. вещество разрушилось всего лишь на 48%. Штамм Ps. putida B-2950 специально для сравнения его деструктивных свойств выращивают в колбах Эрленмейера на встряхивателе АВУ-6с (100 колебаний в 1 мин) в синтетической среде следующего состава, мг/л: Na₂HPO₄ 6000; KH₂PO₄ 3000; NaCl 500; NH₄Cl 1000; Тритон Х-100 50; pH 7,2. По истечении 24 ч вещество разрушалось полностью. Результаты анализа представлены в табл.2. Из данных табл.2 видно, что штамм В-2950 обладает более высокой деструктивной активностью. Изучение деструктивной активности штамма В-2950 на реальных сточных водах экспериментальной фабрики спортивного трикотажа г.Саратова, содержащих неиногенное ПАВ ОП-10 в концентрации 120 мг/л, показало, что при увеличении его в среде культивирования до 200 мг/л (дополнительным внесением этого соединения для получения возможности сравнения с данными лабораторного исследования деструктивной активности) содержание ОП-10 в среде через 72 ч снижается с 200 мг/л до 45 мг/л, что является концентрацией более низкой, чем предельно допустимая для этого соединения.

Формула изобретения

Штамм бактерий Pseudomonas putida Б-2950 (Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов Института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2950), используемый для очистки сточных вод от алкилфенолэтоксилатов типа ОП формулы
CnH_2n+1 C₆H₁O (C₂H₁O)_mH,
где n = 8 - 10 для всех веществ;
m - цифровое обозначение препарата, m = 4 - 10.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 11-2002

Извещение опубликовано: 20.04.2002        

---