Штамм @ @ 15118-продуцент антибиотического комплекса и способ получения антибиотического комплекса

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретения - изыскание штамма, способного продуцировать новый антибиотический комплекс, который обладает помимо антимикробной активности противоопухолевой активностью. Штамм Micromonospora sp, NRRL 15118 является продуцентом антибиотического комплекса М 9026. Штамм выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации при 26-30°С и рН 6,0-8,5. Затем культурапьную жидкость или мицелий экстрагируют органическим растворителем, таким как этилацетат, метилэтилкетон, э танол и др., при рН 3,5- 8,5. Очистку проводят методом хроматографии и при необходимости антибиотический комплекс разделяют на составляющие его факторы 1-3. Для выделения факторов 2 и 3 проводят разделение комплекса на колонке с силикагелем и элюируют смесью хлористого метилена и метанола при соотношении последних 9:1. Экстракция при рН 7,0 дает выход комплекса 390 мг, ПО мг фактора 1, 90 мг фактора 2, 91 мг. фактора 3. 2 с. и 1 з.п.ф-лы. СО см

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21). 3637906/28-13 (22) 25.08,83 (31) 8224512 (32) 26.08.82 (33) СБ (46) 07,03.87. Бюл.9 9 (71) Группо Ленетит С.П.А.(IT) (72) Джорджо Ннрали, Хермес Пагани, Мария Гранди, Мануэлла Патерностер и Джорджо Тамони (iT) (53) 615,779.93(088,8) (54) ШТАММ И!СВОИОИОЬРОВА SP.NRRI

15118 — ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО KOMEIEKCA (57) .Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.

Цель изобретения — изыскание штамма, способного продуцировать новый антибнотнческий комплекс, который обладает помимо антимикробной активности противоопухолевой активностью. Штамм., SU „„1296009 А 3 (51)4 0 12 Р 1/06//(С 12 P 17Ъ6;\

Hi cromonospora sp. NRRL 15118 является продуцентом антибиотического комплекса М 9026. Штамм выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации при о

26-30 С и рН 6,0-8,5. Затем культуральную жидкость или мицелий экстрагнруют органическим растворителем, таким как этилацетат, метилэтилкетон, этанол и др., при рН 3,58,5. Очистку проводят методом хроматографии и при необходимости антибнотический комплекс разделяют на составляющие его факторы 1-3. Для выделения факторов 2 и 3 проводят разделение комплекса на колонке с силикагелем и элюируют смесью хлористого метилена и метанола при соотношении последних 9:1. Экстракция при рН 7,0 дает выход комплекса 390 мг, 110 мг фактора 1, 90 мг фактора 2, 91 мг. фактора 3. 2 с. и 1 э.п.ф-лы.

L2 9600

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков, Цель изобретения — изыскание штамма, способного продуцировать новый антибиотический комплекс, который обладает помимо антимикробной активности противоопухолевой активностью, Штамм Мicromonospora sp, выделен i0 в штате Нангал (Индия) и депонирован в коллекции сельскохозяйственных культур NRRL США под номером NRRL

151 i 8.

Культурально-морфологические при- 15 знаки, Хорошо растет на различных питательных агарах. На овсяном агаре колонии с диаметром 2 — 3 мм имеют правильные контуры и складчатые поверхности. Воздушный мицелий всегда отсутствует.

При исследовании под микроскопом установлено, что мицелий имеет удлиненную, разветвленную форму и диаметр

0,6 мкм, а также происходит обильное образование овальных или сферических спор с диаметром 0,7-1,0 мкм. Бесчеренковые споры развиваются непосредЗО ственно из мицелия и зарождаются главным образом на симподиально разветвленных спорофорах.

Рост на питательных средах определяют через 7-14 дн инкубирования при 30 С. Цвет определяют по методу

Иэрца и Паула.

Овсяный агар: рост умеренный, шероховатая, светло-оранжевая, коричневатая поверхность (12Е8), Крахмальный агар с неорганическими солями: обильный рост, шероховатая оранжевая поверхность (11Г11).

Глицерин-аспарагиновый агар: плохой рост, гладкая поверхность с цветом от прозрачного до светло-оранже45 вого.

Железный агар с пептонно-дрожжевым экстрактом: умеренный рост, морщинистая поверхность, янтарного цвета (12 09) .

5О

Тирозиновый агар: плохой рост, гладкая поверхность, прозрачная, Овсяный агар (по Ваксману): обильный рост, гладкая поверхность, цвет оранжевый, темноватый, влажная.

Агар Хики и Треснера: обильный рост, морщинистая, коричневая поверхность.

Глюкоза-аспарагиновый агар: плохой

2 рост, гладкая поверхность, цвет от прозрачного до светло-оранжевого.

Питательный агар: умеренный рост, гладкая поверхность, цвет оранжевый (10Т9), Картофельный агар; обильный рост, морщинистая, черновато-оранжевая поверхность, влажная. Агар Беннета: обильный рост, гладкая, оранжево-коричневая поверхность. Агар с яблочно-кислым кальцием: плохой рост, гладкая, прозрачная поверхность ° Агар со снятым молоком: умеренный рост, гладкая, оранжевая по— верхность (11С10)

Физиолого-биохимические признаки.

Усваивает арабиноэу, ксилозу, глюкозу, маннозу, сахарозу, лактоэу, раффиноэу, мелибиозу, галактозу, целлобиозу, прегалоэу и растворимый крахмал. Плохо усваивает фруктозу; не усваивает маннит, инозит, рамноэу, целлюлозу, салицин, рибоэу, дульцит и глицерин.

Гидролиэует крахмал и казеин, образует Н S не образует меланин, реакция на тироэинаэу отрицательная, гидролизует яблочно †кисл кальций, восстанавливает нитраты в нитриты, коагулирует молоко Литмуса. Разжижает желатину.

Для получения антибиотика с использованием штамма 15118 в качестве источника углерода можно использовать глюкозу, крахмал, мальтоэу, сахароэу, галактозу, целлобиоэу, раффинозу, фруктозу, декстрин, мелассу, а также масло земляного ореха, кукурузное масло, рыбий жир, соевое масло н т.п.

В качестве источника азота можно испольэовать дрожжевые экстракты,, аминокислоты, каэеиновый гидролизат, мясной экстракт, соевую муку, пептоны, овсяную муку, соевую муку, соевую мелочь, муку иэ хлопкового семени и т.д, В качестве неорганических солей, которые можно вводить в питательную среду, применяют растворимые соли, дающие ионы натрия, калия, железа, цинка, кобальта, магния, кальция, аммония, хлорида, карбоната, сульфата, нитрата, фосфата и т.д, Штамм растет при 25-37 С, предпочтительно при 26-30 С, рН ферментационной среды 6,0 - 8,5 °

Пример i. Культуру Micromonospora sp, NRRL 15118 вносят в среду следующего состава,г/л водопро1296009 водной воды: дрожжевой экстракт 5,мясной экстракт Ç,триптон 4,декстроза 1, крахмал 24, СаСО> 4. Колбы инкубируют в течение 48 ч при 30 "С при встряхивании. 5

Полученный инокулят вносят в ферментационную среду следующего состава, г/л водопроводной воды: дрожжевой экстракт 2, казеиновый гидролизат 4, мясной экстракт 2, декстроза 10, крахмал 20, СаСО 3.

Ферментацию ведут в аэробных глубинных условиях при перемешивании при 26-30 С и рН 6,0 — 8,5, Максимальная антибиотическая активность достигается через 72 ч ферментации.

Культуральную жидкость в объеме

100 л фильтруют, устанавливают в фильтрате рН 7 и экстрагируют дважды равными объемами этилацетата. Органические экстракты сливают и концентрируют в вакууме до 1/100 первоначального объема, Осадок выделяют фильтрацией. Дополнительное количе25 ство целевого продукта получают в результате обработки маточного раствора этиловым эфиром. После фильтрации твердую фазу регенерируют и сушат в вакууме при комнатной температуре. Получают антибиотический комплекс — сырец, Hp и м е р 2. Выделение фактора

1 антибиотика М9026.

Отфильтрованную мицелиальную массу 35 промывают водой, устанавливают рН и 7,0 и смесь суспендируют в метаноле при перемешивании в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют и метанол упаривают из фильтрата. В полученном водном слое устанавливают рН 7,0 и экстрагируют этнлацетатом аналогично примеру 1.

Полученный фактор 1 антибиотика можно очистить (согласно примеру 3).

Из мицелия, регенерированного из

200 л ферментационного бульона, получают 110 мг фактора I. При экстракции мицелия при рН 3,5 выход фактора

1 составляет 65 мг, а при рН 8,5—

70 мг.

Фактор 1 характеризуется следующими физико †химически характеристик ами °

Кристаллическое твердое вещество с т.пл. около 235 С. Растворим в хлороформе, метаноле, менее растворим в ацетоне, гидрокарбидах, иерастворим в воде.

Элементный состав, 7.: С 68,83;

Н 8,70; М 5,56; О 16,91 °

ИК-спектр, сл» : 3670; 3550;

3460; 3320; 3100; 3080; 3040; 2740;

1720; 1660; 1630; 1545; 1500; 1260;

1245; 1220; 1190; 1140; 1090; 1040;

985; 950; 895; 750; 725; 700.

УФ вЂ спек: концевая адсорбция при 215 нм в метаноле.

ЯМР-спектр: S 0,70 — 0,73 (2 дублет, 6Н, I = 6,5); 0,83 (дублет, 6Н, I-. = 7); 1,0 — 2,0 (мультиплет, 4Н)1 1,06 (мультиплет, IН); 1,24 (дублет, ЗН, I = 6,5); 1,5 — 2,0 (мультиплет, 2Н); 1,66 (мультиплет, 2Н); 1,66 (триплет-септет, IН,I

7,5); 1,98 (тройной дублет, 2Н, 7,5 — 7,5 — 1); 2,49 (тройной дублет, IН, IН, I = 7-10; 2,5);

3,00 (дублет, 2Н, = 7,5); 3,91 (четверной дублет, !Н, = 9:

2,5 — 9,5); 4,08 (двойной дублет, IН);

4,32 (двойной дублет-квартет, IН вЂ” 2,5 10); 4,57 (дублет-триплет, !

Н, = 8); 5,69 (дублет-триплет, 1H, I = 15); 6,15 (дублет IН); 6,22 (дублет !Н); 6,73 (дублет-триплет, IН); 7,18 (мультиплет, 5Н), Масс-спектр, m/z (7. от.инт.): 486 (35); 91 (18); 111 (81); 120 (37); 216 (18); 217 (19)i 230 (70); 231 (34) 258 (100); 344 (48); 372 (8%3); 395 (3,5)э 486 (296)э 471 (1,1)

Пример 3. Очистка антибиотического комплекса.

l,5 r сырого комплекса (пример 1) растворяют в 10 мл элюирующей смеси (хлороформ: метанол:гидроокись аммония в соотношении 60:30:4) и очищают с помощью хроматографической колонки с силикагелем. Колонку проявляют указанн и смесью и отбирают фракции объемом 15 мл под постоянным контролем антибиотической активности, например с помощью S.aureus в качестве тест-микроба ° Фракции объединяют по активности. К концентрированным объединенным фракциям добавляют этиловый эфир для осаждения очищенного комплекса (можно испольэовать изопропиловый или петролейный эфир).

Выход антибиотического комплекса составляет 390 мг. При экстракции при рН 3,5 выход составляет 260 мг, при рН 8,5 — 280 мг.

09 6

5 12960

Пример 4. Выделение факторов 2 и 3 антибиотического комплекса М9026.

340 мг комплекса очищенного по примеру 3 растворяют в 5 мп смеси хлористого метилена и метанола, взятых в соотношении 9:1, Раствор пропускают через хроматографическую колонку с 30 r силикагеля. Эту же смесь растворителей используют для !О проявления колонки, отбирая фракции по 15 мл. Фракции объединяют по активности и содержанию целевого продукта, Объединенные фракции концентриру- !5 ют в вакууме. Каждый концентрат добавляют в этиловый эфир для осаждения целевого продукта. Выделяют

90 мг фактора 2 и 91 мг фактора 3.

При проведении процесса экстракции 20 при рН 3,5 выход фактора 2 составляет

50 мг, фактора 3 — 55 мг, а при рН

8,5 выход фактора 2 — 55 мг, фактора

3 — 60 мг.

Фактор 2 представляет собой светло-серый порошок с т.пл.выше 280 С.

Он растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, этилацетате, хлороформе; ограниченно растворим в ацетонитриле, нерастворим в воде, петролейном эфире, этиловом эфире.

Элементный состав, 7: С 68,82;

Н 9,04; N 5,70; О 17,09.

ИК-спектр, см ": 3340; 3295;

3070 2730! !720 !670 1655, 16301

1540; 1500; 1270; 1240; 1215; 1190;, 1140; 1090; 1040; 980; 945; 760;

720; ?00.

УФ-спектр: абсорбция при 215 нм.

ЯМР-спектр: S 0,78 (дублет, 6Н, I = 7); 0,87 — 0,90 (2 дублет, 6Н, I =, 6,5); 1,4 — 2,0 (мультиплет, 8Н);

1,24 (дублет, ЗН; 1 = 6,5); 1,27 (дублет, ЗН; = 7); 1,92 (тройной дублет,2Н, I = 7,5-7 5 — 1); 2,60 (тройной дублет, !Н, = 2,5-7-11);

3 27 (дублет квартет, 1Н; = 9)

4,08 (четвертной дублет, IH 9, 9-9-2); 4,14 (двойной дублет, IH);

4,38 (двойной дублет-квартет, IН, 2-11); 4,54 (двойной дублет, IН,T.= .= 8); 5,62 (дублет-триплет, IН, I

15); 6,13 (дублет, 1Н); 6,60 (дублет-триплет, IH) 7,23 (мультиплет, 5Н); 7,27 (дублет, IН).

Масс-спектр, 7: 500 (9); 105 (28);

111 (78); 134 (40); 230 (12); 231 (20); 244 (82); 245 (34); 272 (100);

358 (42); 386 ()8); 395 (34); 482 (6); 485 (3).

= 0,54 (при использовании в качестве элюирующей смеси системы хлористый метилен:метанол в соотношении

95:1) и Rf = 0,76 (смесь хлористый метилен:метанол = 9:I), Фактор 3 представляет собой белое кристаллическое вещество с т.пл. около 110 С.

Элементный состав, 7.: С 67,01;

Н 9,24; и 5,52 О 18,33.

ИК-спектр, 7.: 3700; 3610; 3420;

3300; 3040; 2960; 2935; 2880; 1 730.;

1665; 1635; 1600; 1500; 1455; 1435;

1370; 1275; 1235; 1200; 1!70.

УФ-спектр: терминальная абсорбция при 215 нм в среде метанола.

ЯМР-спектр: S 0,88 (дублет, 6Н, 7); 0,91 — 0,94 (2 дублет, 6Н, — 7); 1,4 — 2,0 (мультиплет, 8Н);

1,16 (дублет, ЗН; = 6 5); 1,3! (дублет, ЗН, I = 7); 1,99 (тройной дублет, 2Н, = 7-7-1); 2,49 (тройной дублет, IН, = 2,5; 7-11);

3,07 (широкая, IН); 3,34 (дублетквартет, 1Н, I = 8); 3,68 (S ÇH);

3,70 (мультиплет, IН); 3,75 (двойной дублет, IН, I = 10); 3,88 (широкая, 1H) 4,01 (четвертной дублет, I

9, = 2" 11); 4,54 (двойной дублет, lH, I = 9); 5,62 (дублет-триплет

IН, I = 15); 6,16 (дублет, IН); 6,52 (дублет, IН); 6,65 (дублет-триплет, 1Н); 7,27 (мультиплет, 5H).

Масс-спектр, 7: 532 (0,6); 105 (28); ill (76); 134 (40); 230 (12);

231 (20); 244 (82); 245 (34); 272 (100); 358 (40); 386 (6); 395 (5);

427 (7); 482 (2); 500 (1,2). Rf

= 0,41 (при использовании смеси хлористый метилен:метанол в соотношении

95:l в качестве элюирующей смеси) и Rf = 0,63 (смесь хлористый метилен.метанол = 9:1), Комплекс антибиотика М9026 и его факторы 1 — 3 обладают антибактеоиальной активностью in vitro, особенно против грамположительных бактерий, а также цитотоксической активностью

In vitio и противоопухолевой активностью in vivo °

Формула изобретения

1 ° Штамм И i с ГcNlonospo I s p °

NRRL 15118 (Agr! cul tura1 Reseach

Culture CoI Iect ion) — продуцент антибиотического комплекса, 1296009 8 экстракцией устанавливают рН 3,5

8,5, целевой продукт подвергают хроматографической очистке и при необходимости антибиотический комплекс разделяют на факторы 1 — 3 °

Составитель Г.Смирнова

Редактор И,Дербак Техредл.Олейник Корректор Л. Пилипенко

Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5.

Заказ 629/63.Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

2. Способ получения антибиотичес кого комплекса, заключающийся в том что штамм Мicromonospora sp. NRRL

15118 выращивают при 26 — 30 С и рН

6,0 — 8,5 в глубинных аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта путем экстракции культуральной жидкости или 50 мицелия,этил-,бутил- или пропилацетатом, бутилпропионатом, метилэтилкетоном, хлороформом, хлористым метиленом или этанолом, при этом перед

3. Способ по п,2, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью выделения фактора 2 и/или фактора 3, антибиотический комплекс разделяют хроматографически на колонке с силикагелем и элюируют целевой продукт смесью хлористого метилена и метанола в соотношении 9:1.