Способ получения культуры эмбриональных клеток лейдига

 

Изобретение относится к медицине , точнее к цитологии. Цель изобретения - повьшение выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью путем Использования эмбриональной ткани семенников человека 14-24-недельного возраста, селективного вьщеления клеток Лейдига с помощью фермента коллатилина, дезагрегации ткани в охлажденной среде с 2%-ной сывороткой крупного рогатого скота. Тестостеронсинтезирующую активность клеток Лейдинга семенников определяют в экстрактах растущих культур радиоизотопным методом. с со со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (5D 4 G 01 N 1/28

®CFr :1 ю

/ 4

4., ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

t г

) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3679480/28-14 (22) 26.12.83 (46) 15.06.87. Бюл. У 22 (7 1) Ереванский филиал Всесоюзного научного центра хирургии ANH СССР (72) М.Е. Басмаджян, В.И. Геворкян, И.Д. Кирпатовский и С.С. Гамбаров (53) 616-0.88 ° 8(088.8) (56) Полл Дж. Культура клеток ° М.:

Медицина, 1969, с. 11.

Турчина И.С. Изучение структуры и функции клеток эндокринных желев методом культуры тканей. Автореф.дис.

1975, с. 25 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ЭМБРИ-

ОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЛЕЙДИГА (57) Изобретение относится к медицине, точнее к цитологии. Цель изобретения — повьппение выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью путем использования эмбриональной ткани семенников человека

14-24-недельного возраста, селективI ного выделения клеток Лейдига с помощью фермента коллатилина, дезагрегации ткани в охлажденной среде с

27-ной сывороткой крупного рогатого скота. Тестостеронсинтезирующую активность клеток Лейдинга семенников определяют в экстрактах растущих культур радиоизотопным методом. а

1317305 2

Изобретение относится к медицине, а именно к цитологии.

Цель изобретения — повышение выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью благодаря использованию эмбриональной ткани семенников человека 14-24-недельного возраста, возможности селективного выделения клеток Лейдига с помощью фермента коллалитина, дезагрегации ткани в охлажденной среде с 2Х-ной сывороткой крупного рогатого скота.

Способ осуществляют следующим образом.

Семенники извлекают у плодов

14-24-недельного возраста на уровне повздошной ямки или в брюшной части пахового кольца стерильно и помещают во флакон с Хенксом с добавлением антибиотиков (канацимин). После многократной промывки органов Хенксом удаляют соединительную наружную оболочку. Содержимое белочной оболочки выдавливают пинцетом, мелко расстригают и заливают дезагрегирующей смесьи. Диспергирующая смесь состоит из Версена и отечественного фермента коллалитина (на 100 мл Версена

25 мг 0,2 -ного раствора коллалитина). Ткань со смесью помещают в теро мостат при 37 С и инкубируют 10 мин, после чего осторожно удаляют дезагрегирующую смесь, а кусочки ткани семенников заливают охлажденной средой 199 с ?7-ной сывороткой крупного рогатого скота и помещают на магнитную мешалку. Отмывание ведут при 410 С„ Экстракты собирают до полного истощения ткани. Клетки осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадок удаляют, а клетки ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из равных объемов сред

199 и гидролизата лактальбумина с

207.-ной сывороткой крупного рогатого скота. Культивирование проводят при о

37 С при посевной дозе 800 тыс,кл/мл.

Тестостеронсинтезирующую активность клеток Лейдига семенников определяют в экстрактах растущих культур радиоизотопным методом.

Пример 1. В качестве источника получения клеток Лейдига семенников используют эмбриональную ткань семенников человека 14-недельного возраста. Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводят смесью, состоящей из отечественного коллалитина с Версеном (на 100 мл Берсена 23 мг 0,2Х-ного раствора колла-.. литина). Ткань, залитую дезагрегирующей смесью, помещают в термостат при 37 С на 10 мин. После удаления дезагрегирующей смеси диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в среде 199 с 27.-ной сывороткой крупного рогатого скота до полного истощения ткани. Осажденные центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин клетки ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из разных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением

207-ной сыворотки крупного рогатого скота, Рассев клеток проводят при посевной дозе 800 тыс. кл./мл по 2 мл о во флаконы и культивируют при 37 С.

Через 24 ч отмечают прикрепление, распластывание и рост эмбриональных клеток Лейдига семенников человека.

Через 48 ч отмечают формирование монослоя. К этому времени монослой состоит в основном из клеток нолигонального типа, плотно прилегающих друг к другу. Цитоплазма этих клеток богата мелкозернистым материалом и вакуольными включениями, положительно окрашивающимися судановыми красителями. Размер и форма клеток, ядер вариабельны.

5

Уровень определяемого в экстрактах тестостерона достигает 1,8 нг/мл.

Пример 2. Для получения монослоя клеток Лейдига используют ткань 24-недельного плода человека.

Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводят смесью (на

100 мл Версена 23 мг 0,2 -ного раствора коллалитина). Ткань, залитую дезагрегирующей смесью, помещают в о термостат при 37 С на 10 мин. После удаления дезагрегирующей смеси диспергирование ткани проводят на магнитной мешалке в среде 199 с 27.-ной сывороткой крупного рогатого скота до полного истощения ткани. Осажденные центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин клетки ресуспендируют в 10 мл ростовой среды, состоящей из .равных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением

207-ной сыворотки крупного рогатого скота, и засеивают во флакон емкостью

100 мл. Посевная доза 800 тыс.кл./мл, формирование полного монослоя отмечают через 48 ч, 11онослой представлен однородными клетками полигонального

1317305 4 мента в среде 199 с последующим культивированием в составе, содержащем среду 199, гидролизат лактабульмина и сыворотку крупного рогатого скота, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода клеток с высокой тестостеронсинтезирующей активностью, используют семенники человека 14-24-недельного возраста, при

10 этом дезагрегацию проводят в раство- . ре Версена дополнительно содержащем . 0,2Х-ный раствор коллалитина, а отмывание ведут при 4-10 С в среде, дополнительно содержащей 2Х-ную сыво15 ротку крупного рогатого скота. типа. Уровень тестостерона в экстрактах достигал 8 нг/мл, Использование способа получения культуры эмбриональных клеток Лейдига обеспечивает 100Х эффект получения 5 однородных культур клеток Лейдига из семенников 14-24-недельных плодов человека.

Формула из обрете ния

Способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига путем измельчения ткани семенника, ее дезагрегации в растворе Версена с цротеолитическими ферментами, отмывание от ферСоставитель М. Позняк

Техред Л.Олейник Корректор Е. Рошко

Редактор В. Ковтун

Заказ 2414/37 Тираж 776 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР .по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4