Способ получения факторов 1,2,3,4,5 тейхомицина @ и их солей

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотиков - факторов 1,2,3,4, 5 тейхомицина А. Цель изобретения - разработка способа разделения тейхомицина AJ, на факторы 1,2,3,4,5 и получение их солей, сущность способа сводится к тому, что тейхомицин Aj, полученный при культивировании Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31121, растворяют, подвергают обратнофазной хроматогра фии на колонке, заполненной спланированным силикагелем, Элюцию проводят с помощью линейного градиента от 10 до 20% ацетонитрила в 0,2%-ом растворе аммонийформиата. Соединяют фракции сходного профиля, концентрируют с помощью бутанола и осаждают смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг фактора 1 и 770 мг фактора 2 в чистом виде. Далее смесь факторов 3 и 2 и факторов 4 и 5 пропускают через колонку, заполненную . октадецилсиланом, элюируют смесью водного 0,2%-го раствора формиата аммония и ацетонитрила в соотношении 76:24. Фракции отбирают, обессоливают и осаждают аналогично получению фактора 1 и 2. В результате получают дополнительно 510 мг фактора 2, -а также 520 мг фактора 3, 350 мг фактора 4 и 300 мг фактора 5. Полученные антибиотики обладают активностью в отношении грамположительных микроорганизмов . 4 табл. i СО со х 04

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

C i г и

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

НПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3604953/28-13 (22) 07,06.83 (31) 8216590 (32) 08.06.82 (33) СВ (46) 15.06.87. Бюл. N - 22 (71) Группо Лепетит С.п.А. (IT) (72) Анджело Борги, Роза Палланца, Каролина Коронелли и Джованни Кассани (IT) (53) 615.779.93(088,8) (56) Патент. Бельгии 11 - 839259, кл. С 12 11, 1976. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ 1,2, 3,4,5 ТЕЙХОИИЦИНА А И ИХ СОЛЕЙ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения антибиотиков — факторов 1,2,3,4, 5 тейхомицина А . Цель изобретения— разработка способа разделения тейхомицина А на факторы 1,2,3,4,5 и получение их солей, сущность способа сводится к тому, что тейхомицин

А, полученный при культивировании

Actinoplanes teichomyceticus nov.

„80„„1 1 170 АЗ (51)4 С 12 Р 1/06 // (С 12 Р 1/06

С 12 R 1:045) sp. АТСС 31121, растворяют, подвергают обратнофазной хроматографии на колонке, заполненной спланированным силикагелем. Элюцию проводят с помощью линейного градиента от 10 до 20% ацетонитрила в 0,27-ом растворе аммонийформиата. Соединяют фракции сходного профиля, концентрируют с помощью бутанола и осаждают смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг фактора 1 и 770 мг

-фактора 2 в чистом виде. Далее смесь факторов 3 и 2 и факторов 4 и 5 пропускают через колонку, заполненную октадецилсиланом, элюируют смесью водного 0,27-го раствора формиата аммония и ацетонитрила в соотношении

76:24. Фракции отбирают, обессоливают и осаждают аналогично получению фактора 1 и 2. В результате получают дополнительно 510 мг фактора 2, а также 520 мг фактора 3, 350 мг фактора 4 и 300 мг фактора 5. Полученные антибиотики обладают активностью в отношении грамположительных микроорганизмов. 4 табл.

Таблица!

Время удерживания, ми н

Фактор тейхомицина А

22,6

23„3

25,8

26,4

3 5"Диокситолуол вн т енний эталон

8 84

I 13181

Изобретение относится к биотехно- логии, в частности к производству антибиотиков.

Целью изобретения является создание способа получения новых антибиотиков — факторов I 2,3,4,5 тейхомицина А и их солей.

Пример 1. IO r тейхомицина

А, полученного путем культивирования штамма Actinoplanes teichomyce- 10

ti,cus nev. sp. АТСС 31121, растворяют в 1 л 0,2Х-ной смеси формиата аммония и ацетонитрила (9:1). Значение рН полученного раствора с помощью

1 н. раствора гидроокиси натрия доводят до 7 5. Раствор пропускают через колонку, содержащую 500 r силанированного силикагеля 60 фирмы Иерк.

Затем колонку злюируют с помощью линейного градиента 10-20Х ацетонитрила в 0,2%-ном растворе формиата аммония при общем объеме 10 л.

Фракции (около 20 мл) собирают и исследуют с помощью ВТХ (тонкослойная хроматография под высоким давлением): колонка: 5 мк Lorbax ® 0DS (фирмы Дюпон (Du Pont); подвижная фаза: линейный градиент О-50Х-ный раствор Б в А в течение 40 мин .раствор А: 25 мИ НаН РО4/ацетонитрила ЗО (9:1), забуферованный до рН 6,0 посредством 0,1 н. NaOH; раствор Б;

25 мИ NaH РО /ацетонитрила (3:7), забуферованный до рН 6,0 посредством 0,1 í. NaOH); скорость потока

2 мл/мин; детектор: УФ-фотометр при

254 нм.

В табл. 1 указаны времена удерживания t для факторов 1, 2, 3, 4 и 5 тейхомицина А в показательном про- щ цессе разделения с помощью БТХ с указанием в ней условий проведения хроматографии. !

70 2

Фракции со сходным профилем ВТХ собирают и органический растворитель упаривают под пониженным давлением.

Оставшиеся водные растворы пропускают через колонку, содержащую 10 r силанированного силикагеля 60 фирмы

Иерк. Колонку затем промывают дистиллированной водой в целях удаления формиата аммония и элюируют

50Х-ным водным ацетонитрилом. Элюат концентрируют до небольшого объема путем добавления бутанола для облегчения упаривания воды и осаждают его смесью ацетона и диэтилового эфира (1:1). Получают 410 мг фактора

1 и 770 мг фактора 2 тейхомицина А в чистом вице.

Смесь факторов 3 и 2 тейхомицина

A (1:1) подвергают дальнейшей очистке с помощью ВТХ на полупрепаративной колонке при следующих условиях: колонка: Mhatman Part is i 1® ODS

И 9 10/50 (содержащая октадецилсилан); подвижная фаза: 0;2Х-ный формиат аммония в смеси Н О и ацетонитрила (76:24); скорость потока:

4,5 мл/мин; детектор: УФ-фотометр при 254 нм; загрузка: 20 мг, Очистку проверяют исследованием каждой фракции с помощью ВТХ, Фракции, содержащие чистый фактор

2 и 3 тейхомицина А, собирают, обессоливают и осаждают, как описано.

Выход:510 мг фактора 2 и 520 мг фактора 3.

Фракции, содержащие факторы 4 и

5 в соотношении 1:1 (около 500 мг), полученные из первой колонки, объединяют с другой смесью фракций, содержащей факторы 4 и 5 (около 490 мг) и полученной в результате проведения второго параллельного процесса разделения путем полупрепаративной ВТХ, разделяют при условиях, описанных для очистки фактора 3 тейхомицина

А, с получением 350 мг фактора 4 и

300 мг. фактора 5.

Фактор 1 тейхомицина A представляет собой белый аморфный порошок, о который при температуре около 220 С о начинает темнеть и при 255 С полностью разлагается, Химико-физическая характеристика его следующая: а) легко растворим в воде при зна- чении рН вьш е 7,0 или ниже 2,.а также в ДИФ, ДИСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине, слаборастворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хпо1318170 роформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле, диэтиповом эфире, ацетоне, .этилацетате, тетрахлорметане; б) имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения: в 0,1 н. хлористоводородной кислоте

278 нм (Е, =49,5), в фосфатном буфере при значении рН 7,4 Ъ, f"é макс

278 им (Е, =50,0), в 0,1 н. гидро ьсм . о окиси натрия Ъ„ „с 297 нм (Е =72,1); fO

1см в) имеет спектр ИК-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль) 1305, 1230, 1180,15

1155, 1060, 1025, 970, 890, 845, 815, 720 (нуйоль); г) элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при темпе6 ратуре около 140 С в инертной атмос- 20 фере (X ды=8 5) показывает следующий приблизительный средний процентный состав, : С 56,70; Н 4,90, N 6,65, Cl 3,80, О (вычислен как остаток до 100X) 27,95; 25 д) время удерживания (t ) составляет 21,2 мин в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lorbax® ODS и элюий рованием с помощью линейного градиента, Π— 50X-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон: 3 5-диокситолуол при t

8,84 .мин); е) в ДМСО-d с добавлением не35

6 скольких капель D 0 с концентрацией

25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внут реннего эталона: 3 =0,00 ч. на млн получают следующие группы сигналов в ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,8-1,5(и), 1,7-2,3 (м,); 2,7-4,0 (м.); 4,04,7 (м.); 4,8-5 8 (м.); 6,2-8 1 (м.); ж) имеет кислотную функцию, способную образовать соли; э) имеет солеобразующую основную функцию; и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией с использованием скорой атомной бомбардировки (САБ)в качестве источника ионов, составляет около 1875.

Фактор 2 тейхомицина А представ2 ляет собой белый аморфный порошок, который после нагреваний до 2)0 С начинает темнеть и разлагается пол6 ностью при 250 С. Его характеристика следующая:

4 а) легко растворим в воде при значении рН вьппе 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицег рине, слабо растворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане. б) имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения: в 0,1 H. хлористоводородной кислов фосфатном буфере при значении

4 278 (Е 4 4 и

297 нм (Е см =70 в) имеет спектр ИК-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2860 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1260, 1230, 1180, 1150, 1060, 1025, 9?О, 890, 845, 815, 720 (нуйоль); г) элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 140 С в инертной атмосфере (% оw=9,8), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, X.: С 56,15; Н 5,15;

N 6,30; С1 3,90, О (вычислен как остаток до 100 ) 28,50; д) время удерживания (й,к) в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк LorЬах® ÎDS и элюированием с помощью линейного градиента 0-50Х-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 22,6 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3,5-диокситолуол, t 8,84 мин); е) в ДМСО-d ь с добавлением нескольких капель Dz0 с концентрацией

25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внутреннего эталона: а =0,00 ч. на млн получают следующие группы сигналов в ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5(м)

1,8-2,2 (м.); 2,7-4,5 (м.); 4,65,7 (м.); 6,2-8,1 (м.); ж) имеет кислотную функцию, способную образовывать соли; з) имеет солеобразующую основную функцию; и) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1877, к

Фактор 3 тейхомицина А представ2 ляет собой белый аморфный порошок, который после нагревания до 205 С

1318170 начинает разлагаться с полным разлоо жением при 250 С. Он имеет следующую характеристику: а) легко растворим в воде при значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ,* ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине, слабо растворим в метаноле и этаноле. и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, аце- 10 тонитриле, диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане. б) имеет спектр У@-поглощения со следующими максимумами поглощения: в 0,1 н. хлористоводородной ки- 15 слоте Ъ „278 нм (Е „=49,2), в фосфатном буфере при значении рН 7,4, Ъ М,„„278 нм (Е„, =50,8), в О, 1 н. гидроокиси натрия м „ 297 нм (Е„ =

=72,7); 20 в) имеет спектр ИК-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2850 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300,.1230, 25

1180, 1150, 1120, 1060, 1030, 970, 890, 845, 820, 800, 720 (нуйоль); г) элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при температуре около 1400С в инертной атмосфере 30 (% ь w=l2,0), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, % С 56,26; Н 5,20; N 6,69;

Cl 3,95, О (вычислен как остаток до

IОО%) 27,90; д) время удерживания (tö) — в слу чае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк ЬотЪах " ODS и элюированием с помощью линейного градиента Π— 50%-ного раст40 вора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 23,3 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3,5-диокситолуол при t 8,84 мин); е) в ДМСО-d6 с добавлением нескольких капель D О с концентрацией

25 мг/0,5 мл (ТМС в качестве внутреннего эталона =0,00 ч. на млн) получают следующие группы сигналов в ЯМР-спектре 270 МГц Н: 0,7-1,5 (м.); 1,8-2,0 (м.); 2,7-4,5 (м.);, 4,6-5,7 (м.); 6,2-8,0 (м.);

1 ж) имеет кислотную функцию, способную образовывать соли; з) имеет солеобразующую основную 51 функцию; и) молекулярная масса„ определен1 ная масс-спектрометрией САБ, сос"тавляет около 1877.

Фактор 4 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок, который после нагревания до темпео ратуры около 210 С начинает темнеть о и разлагается полностью при 250 С, Он имеет следующую характеристику: а) легко растворим в воде при значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФ, ДМСО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине; слабо растворим в метаноле и этаноле и почтй нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле,диэтиловом эфире, ацетоне, этилацетате, тетрахлорметане; б) имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения: в 0,1 н. хлористоводородной кислоте Ъ„а 278 нм (E„ =52 5) в фосфатном буфере при значении рН 7,4 Я „ „с 278 нм (Е =52,5), в 0,1 н. гидроокиси натрия Ъ „

297 нм (Е„, ==75,5); в) имеет спектр ИК-поглощения в нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль); 1645, 1590, 1510, 1460 (нуйоль), 1375 (нуйоль), 1300, 1230,.

1175, 1140, 1060, 1025, 970, 890, 840, 815, 720 (нуйоль)", r) элементарный анализ пробы, Предварительно высушенной при темпео ратуре около 140 С в инертной атмосфере (% h,w=9,„8), показывает следующий приблизительный средний процентный состав, %: С 56,50; Н 5,10;

N 6,50; С1 3,80; О (вычислен как остаток до 100%) 28,10; д) время удерживания (t ) в слуЯ чае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк Lorbax ODS и элюирования с помощью лиg нейного градиента Π— 50%-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 25,8 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3,5-диокси-толуол, t< 8,84 мин); е) имеет кислотную функцию, способную к солеобразованию; ж) имеет солеобразующую основную функцию; з) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1891, Фактор 5 тейхомицина А представляет собой белый аморфный порошок,о который после нагревания до 210 С начинает темнеть и полностью разлага13181 ется при 250о С. Он имеет следующую характеристику: а) легко растворим в воде при значении рН выше 7,0 или ниже 2, а также в ДМФр ДАССО и пропиленгликоле, малорастворим в метилцеллозольве и глицерине, слаборастворим в метаноле и этаноле и почти нерастворим в хлороформе, бензоле, п-гексане, ацетонитриле, диэтиловом эфире, ацето- 1О не, этилацетате и тетрахлорметане; б) имеет спектр УФ-поглощения со следующими максимумами поглощения: в 0,1 н. хлористоводородной кислоте %„„„к, 278 нм (Etc =49,6), в фосфатном буфере при значении рН 7,4 % „с„„, 278 нм (Е =5 1,8), в 0,1 н. гидрОокиси натрия макс

1с в) имеет спектр ИК-поглощения в. 20 нуйоле со следующими максимумами поглощения: 3700-3100, 2960-2840 (нуйоль), 1645, 1590, 1510, 1460 (нуЙОль ) р 1 375 (нуйОль), 1 300, 1 230 р

1175, 1145, 1060, 1025, 970, 890, 25

840, 815, 720 (нуйоль); г) элементарный анализ пробы, предварительно высушенной при темпео ратуре около 140 С в инертной атмосфере (Х gw=10, 1), показывает следую- 30 щий приблизительный средний процентный состав, Х: С 56,60., Н 5,05, N 6,63, С1 Зр85, О (вычислен как остаток до 1007) 27,87; д) время удерживания (0R) в случае анализа путем обратнофазной ВТХ с использованием колонки 5 мк LorЪах- ОПБ и элюирования с помощью ли-. нейного градиента О-50Х-ного раствора Б в растворе А в течение 40 мин составляет 26,4 мин со скоростью потока 2 мл/мин (внутренний эталон:

3,5-диокситолуол при t < 8,84 мин); е) имеет кислотную функцию, способную образовывать соли; ж) имеет солеобразующую основную функцию, з) молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией САБ, составляет около 1891.

Каждый из факторов 1-5 тейхомицина Аz содержит кислотный остаток, способный образовывать соли.

Пример 2, Выделение факторов 1-5 тейхомицина А> с применением хроматографической колонки из диэтиламиноэтилсефацеля.

500 мл DEAE-Sephacel (Farmacia

Fine Chemicaks, Швеция) вливают в

70 8 колонку диаметром 4 см и затем уравновешивают с применением 50 ммоль аммонийхлоридного буфера при рН 9,0.

На этой колонке хроматографируют

1 г комплекса тейхомицина А, растворенного в 50 мл того же буфера, элюируя элюирующей смесью, состоящей из того же буфера, с линейным градиентом 0-1 моль хлористого натрия в общем количестве 5 л. Затем собирают около 20 мл фракций, обрабатывают жидкостной хроматографией под высоким давлением, отдельные фракции, содержащие антибиотики, соединяют и обрабатывают в целях выделения веществ — антибиотиков.

Ниже приведены наивысшие концентрации отдельных факторов, мп. элюированного объема:

Тейхомициновый Наивысшая концентфактор рация, мл

Пример 3. Получение солей факторов 1-5.

К солям со щелочными и щелочноземельными металлами относятся соли натрия, калия, лития, кальция и магния ° Аммониевые соли включают аммониевые соли и соли первичного, вторичного или третичного алкиламмония

С, и оксиалкиламмония С„

Соли со щелочными и щелочноземельными металлами получают известными способами. Так, факторы тейхомицина

А в свободном кислотном виде раст2 воряют в пропиленгликоле с последующим постепенным добавлением к полученному раствору стехиометрического количества выбранного минерального основания, осаждением и фильтрацией.

Указанные соли можно также получить практически s безводном виде посредством лиофилизации. В этом случае водные растворы соли, полученные в результате образования солей из свободных кислот с помощью карбонатов или гидроокисей щелочных или щелочноземельных металлов в количествах, обеспечивающих значение рН в

9 131 пределах 7-8, отфильтровывают от нерастворимых веществ и лиофилизуют, Органические аммониевые соли получают добавлением амина к раствору факторов 1-5 тейхомицина А в свободном кислотном виде, например, в пропиленгликоле с последующим упариванием растворителя и избыточного аминного реагента или взаимодействием двух реагентов в минимальном количестве воды с последующим осаждет нием полученных солей путем добавления нерастворителя. .Факторы 1-5 тейхомицина А содерз жат также гидроксидный остаток, за счет которого также могут быть образованы соли путем-взаимодействия отдельных факторов S чистом виде с сильной кислотой, предпочтительно минеральной.

Пример 4. 0,5 г фактора 1, 2,3,4 или 5 тейхомицина А в виде свободной кислоты растворяют в воде (около 50 мл), рН 7,5. Доводят раствор до рН 6,5 1ОХ-ной хлористоводородной кислотой и прибавляют стехиометрическое количество ZnSO„ 7Н,О (или CuS04 5Н О), растворенное в минимальном количестве воды, Смесь перемешивают при комнатной температуре для облегчения образования осадков, которые собирают фильтрованием, дважды промывают ацетоном (около 600 мл) и сушат всю ночь в вакууме при комнатной температуре, Получают 0,43 г (85-88/) цинковой или медной соли фактора 1,2 3 4 или 5 тейхомицина Az.

Пример 5. 0,5 г фактора 1, 2,3 4-или 5 тейхомицина А в виде свободной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила,.Прибавляют воду (около 50 мл), рН 7,5.

Доводят раствор примерно до рН 6,5

107.-ной хлористоводородной кислотой.

Прибавляют стехиометрическое количество ВаС1 (или СаС1 или М8С1 ), растворенное в минимальном количестве воды.

Смесь перемешивают при комнатной температуре. Полученную соль удаляют прибавлением избытка ацетона (около

500 мл) и фильтрованием полученных осадков, которые дважды промывают ацетоном (около 600 ип) и подвергают продолжающейся всь ночь сушке в вакууме при комнатной температуре.

Получают 0,40 r. (84--87K) бариевой (кальциевой или магниевой) соли.

817О 10

Пример б. 0,5 г фактора 1,2, 3,4 или 5 тейхомицина А2 в виде своI бодной кислоты растворяют в минимальном количестве ацетонитрила. Потом прибавляют воду (около 50 мл), рН

7,5, Доводят раствор примерно до рН

6,5 10 -ной хлористоводородной кислотой. Прибавляют стехиометрическое количество основания (в виде концентрированного водного раствора для

KOH или NH 0H или в виде чистого раствора в случае NI, СН, ИН С Иэ, ЫН(снз) ЫН(С 1 ) И(сну)

N(C Н ) и т.д.).

Смесь перемешивают при комнатной температуре. Полученную соль удаляют прибавлением избытка ацетона (около

500 мл) и фильтрованием полученных осадков, которые дважды промывают ацетоном (около 600 мл) и сушат в течение ночи в вакууме при комнатной температуре.

Получают 0,45 г (84-907) соответ- стB IIJей соли, Пример 7 ° Получение натриевой соли фактора 2 тейхомицина А .

Водный раствор фактора 2 тейхомицина А (150 мг, 15 мл) путем до.бавления по каплям 0,1 н. раствора

Na0H доводят до рН 8„0. Полученный раствор фильтруют и переносят в камеру системы сублимационной сушки и замораживают. По завершении замораживания камеру эвакуируют до давления 0,1 Торр и лед сублимируют доведением нагревательной плиты до 0 С, продолжая этот процесс до достижения почти сухого состояния продукта (до влагосодержания около IX). Титрование раствора полученной таким образом натриевой соли фактора 2 тейхоиицина А в 25 мл метилцеллозольва/

Ii О (3:1) с 0,1 н. раствором НС1 показывает присутствие двух титруемых функций, отличающихся следующими значениями рН: 7,03 и 4,78.

По указанной методике получают соответствующие натриевые соли факторов 1, 3, 4 и 5 тейхомицина А . Определение количества натрия в конечных солях подтверждает образование мононатриевой соли.

Бактериостатическую активность факторов 1-5 тейхомицина А in vitro г против грамположительных бактерий определяют на клинических иэолятах бактерий Staphylococcus u Streptococcus с использованием метода двукратного разведения с помощью микро13181 титровальной системы, причем для названных групп бактерий используют .бульоны Пенассея и Тодда-Хьювитта фирмы Дифко. Выращенные в течение ночи бульонные культуры разбавляют до содержания 10 млн кл ./мл. Минимальной бактериостатической конценБактериостатическое действие in vitro

Фактор тейхомицина А

Г :

Микроор Гаиивм

3 4 5 та

0,2-0,8

0,4-0,8 0,2-0,8

5 0,8-1,6 0,8-1,6

0,1-1,6

0,025-0,1

0,05-0,1

4 0,2-1,6

7 0,05-0,1

6 0,1-0,2

0,025 0,050 006-0,05

0,05-0,1 0,05-0, I

0,006-0,05

0>05-0,1

Streptococcus, Streptococcus, pyogenes

pneumoniae

Оэ1-Оэ4 Оэ 1 012 О» Оэ4 Оэ1 Оэ4

5 0,2-0,4

l 0,025

Streptococcus, faecalis

Streptococcus ° mitis

0,0125

0,025

0,025

0,025

0,1

0,1

salivarius

sanguis

fovis Streptococcus,, Streptococcus, 1 0,2 0,2

1 0,1 О,I

0 05

0,05

0,05

0,05

Streptococcus, l 0,4

1 0,1

0,4

0,2.0,4

0,4

Streptococcus, aqalactiae

0,1

0,05

0,1

0,1

Бактериостатическую активность отдельных факторов 1-5 определяют ме- 30 тодом повторного разведения с помощью агаровых пластинок с использованием бактерий штамма S. aureus

АТСС 6538 в качестве испытуемого микроба и смеси тейхомицина А в качестве эталона. При этом одинаковые количества отдельных факторов 1-5 тейхомицина А и смеси последнего в качестве эталона растворяют в ДИФ при концентрации 2000 мкг/мл. Полученные растворы подвергают дальнейшему разведению с использованием

0,067 моль фосфатного буфера для установления рН 7,4 и добавлением

1Х-ной бычьей сыворотки в целях обес- 45 печения следующих концентраций:

2,5; 5, 10 и 20 мкг/мл. Диски фильтровальной бумаги пропитывают растворами пробы и помещают на определенных расстояниях на поверхность

Staphylococcus, aureus

Staphylococcus, epidermidis

70 12 трацией считается самая низкая концентрация, при которой отсутствует видимый рост после инкубации в течение 18-24 ч при 37 С.

Полученные результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2 факторов 1-5 тейкоиицииа А

Л 1.

0,2-0,8 0,2-0,8 0,2-0,8 агаровых пластинок, засеянных суспензией испытуемого микроорганизма, о

Пластинки инкубируют при 37 С в течение !8 ч и измеряют диаметры зон ингибирования °

Ниже приведены результаты испытания:

Фактор тейхомицина А

1 841 О/мг

2 1086 Ul ìã

3 1131 U/мг

4 1066 u/мг

5 954 О/мг

Смесь тейхомицина A 1000 О/мг

Действие факторов 2, 3, 4 и 5 тейхомицина А испытывали в эксперименте с мьппами, зараженными S. pneumoniae u S. pyogenes. Для сравнения брали смесь тейхомицина А .

Полученные результаты указанных опытов приведены в табл. 3.

1318170

Та блица 3

Бактериостатическое действие на мьш ах

Ж .д (MI KI /сут) п/K

Фактор тейхоми ци"а Az

S, pneumoniae L44 S. pyogenes Ь4

2 0,28(0,22-0,34) 0,15(0,13-,0,18) 0,27(0,23-0,32) 0,13(0,11-0,16) 3

4 О, 12 (0,98-0, 14) 0,098(0,073-0, 11)

5 О, 13 (О, 10-0, 15) О, 10 (О, 098-0, 13) Смесь тейхомицина А 0,35(0,28-. 0,44) 0,18(-) Примерная ЛД 0 мг/кг

Фактор тейхомиСина А

01500 «2000

)1500 «2000 1000 «1500

>500 «1000

)500 1000

Приблизительная острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно) для факторов 1-5 тейхомицина А приведеz на в табл. 4, Таблица 4

Острая токсичность на мышах (внутрибрюшинно) I

Из табл. 4 следует, что факторы

1-5 тейхомицина А пригодны для применения в качестве действующего начала в противомикробных препаратах в медицине и ветеринарии для предупреждения и лечения инфекционных заболеваний, вызванных патогенными бактериями, чувствительными к названным соединениям. Предлагаемые соединения можно использовать для лечения инфекционных заболеваний как таковые, т.е. как отдельные факторы или ввиду сходства их характеристик активности и в виде смеси двух или более факторов в любом соотношении.

Соединения вводят орально, местно или парентерально, предпочтитель" но парентерально. В зависимости от способа применения соединения его готовят в различных лекарственных формах, Для орального введения препараты могут представлять собой кап25 сулы, таблетки, жидкие растворы или суспензии. Как известно, капсулы и таблетки кроме действующего начала могут содержать еще обычные инертные наполнители (носители), такие как

30 разбавители, например лактоза, фосфат кальция, сорбит и др., смазки, например стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, связующие, например поливинилпирролидон, желатин, сорбит, трагант, камедь, ароматизирующие вещества, средства, способствующие разложению препарата и смачиватели, Жидкие препараты обычно в виде водных или масляных растворов

40 или суспензий могут содержать, обычные добавки, например вещества, содействующие взвешиванию. Для местного применения соединения можно приготовить в ниде препаратов для введения

4 через слизистые оболочки носа и горла или бронхиальные ткани, обычно в виде жидких аэрозолей или средств для ингаляции, лепешек или тинктур, наносимых на поверхность горла. Для лечения глаз или ушей можно использовать жидкие или полужидкие препараты, Препараты для местного применения можно приготовит:ь на гидрофобной или гидрофильной основе в виде мазей, 55 кремов, лосьонов, тинктур или порошков, впрыскиваемые составы — в виде суспензий, растворов или эмульсий на основе масляных или водных носителей, содержащих вещества, способствующие

Формула и s обретения

Составитель Г.Смирнова

Редактор К.Волощук Техред М.Моргентал

Корректор И.Муска

Заказ 2441/58 Тираж 499 Подписное

BHHHflH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

15 13 взвешиванию, стабилизаторы и/или диспергаторы. Кроме того, действующее .начало может быть приготовлено в виде порошка в целях его воспроизводства во время поставки с пригодным носителем, например, стерильной водой.

Количество применяемого действующего начала зависит от различных факторов, например роста и состояния здоровья пациента (животного), способа и частоты применения препарата и причины заболевания. Как правило, факторы 1-5 тейхомицина А являются

2 эффективными при суточной дозировке в пределах около 0,1-20 мг действующего начала на кг веса, причем эта доза может быть разделена на два приема в день. Целесообразны составы, приготовленные в виде дозировочных единиц с содержанием около 50250 мг действующего начала на единицу

Примеры фармацевтических составов: раствор для парентерального введения из 100 мг натриевой соли фактора 2 тейхомицина А, растворенной в 2 мл стерильной воды для впрыскивания; раствор для парентерального введения из 250 мг натриевой соли фактора 3 тейхомицина А, растворенной в 3 мп стерильной воды дпя впрыскивания; мазь для местного нанесения из 200 мг фактора 2 тейхомицина А

600 мг полиэтиленгликоля 4000 U.S.Р., 1,2 г полиэтиленгликоля 400 U.S.P.

Наряду с применением в виде лекарств предлагаемые соединения можно испольэовать и как промоторы роста животных. С этой цели одно или несколько соединений вводят орально

18170 16 с кормом. При этом выбирается такая концентрация соединений, которая является эффективной для промотирования роста животных. При этом сначала готовят смесь части корма с эффективным количеством действующих соединений, которую затем добавляют к полной порции корма, или с кормом смешивают промежуточный концентрат, cof0 держащий деиствующее начало.

l. Способ получения факторов 1,2, f5 3,4,5 тейхомицина А и их солей, заключаЮщийся в том, что тейхомицин, полученный путам культивирования штамма Actonoplanes teichomyceticus

nov. sp. АТСС 31121, переводят в ра20 створ, подвергают его обратнофазной хроматографии на колонке, содержащей силанированный силикагель, элюируют с помощью линейного градиента от 10 до 20Х ацетонитрила в 0,2Х-ном растворе аммонийформиата, полученные фракции сходного профиля объединяют, концентрируют» осаждают целевые продукты и/или переводят в соли.

30 2 ° Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью допол-. нительного разделения факторов 2, 3, 4, 5 тейхомицина А, смесь факторов

2, 3, 4 и 5 подвергают обратнофазной хроматографии на колонке, содержащей октадецилсилан, элюируют смесью ацетонитрила и 0,2Х-ного водного аммонийформиата в соотношении 24:76 с последующим обессоливанием фракций

40 и осаждением целевых продуктов °