Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

С594 С 12 N 5 О

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

3CECAfAЗн я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 13 ".

Н АBTOPCHOMY СВИДЕ"ГЕПЬСТВУ (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ

MHKP0H0CHTEJIEA ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

КЛЕТОК, включащий получение частиц (21) 3662903/29-13 (22) 23,08.83 (46) 07.07.87. Бюл. У 25 (72) В.П.Грачев, А.E Гутманис, М.А.Завальный, А.Х.Зицманис, M Ê.ÊëÿâHíüè и В.Д.Попова (53) 577.15 (088.8) (56) Nilson К., Mosbach К. — FEBS

Lett. 1980, vol,118, р.145.

Авторское свидетельство СССР

У 1161548, кл. С 12 и 5/00, 1983. из желатинового геля, обработанного поперечно-сливающими реагентами-диальдегидами и стабилизацию гранул добавлением восстанавливающих реагентов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и улучшения качества целевого продукта, частицы геля обрабатывают 0,25-0,75Х-ным раствором протеолитического фермента животного происхождения при объемных соотнощениях раствора фермента к желатиновому гелю 0,75-1,25:1, а перед добавлением восстанавливающих реагентов проводят вторичную обработку диальдегидами.

1321748 2!

О!

Щ 5

Изобретение относится к области биологии и микробиологической промышленности, в частности к выращиванию поверхностно-зависимых животных клеток.

Пель изобретения — увеличение выхода и улучшение качества целевого продукта.

Сущность способа заключа.ется в том, что частицы желатинового геля обрабатывают протеолитическими ферментами животного происхождения (0,25-0,75% †.ный раствор протеолитического фермента при объемных соотношениях раствора фермента к желатиновому гелю (0,75-1,2Я:1,, а после этого проводят вторичную обработку диальдегидами, Продавливанне желатинового геля через сита опрецеленного размера с последующей обработкой частиц протеолитическим ферментом обеспечивает получение микроносителей определенного размера неправильной овальной формы с ровной поверхностью. Данная техно-логия обеспечивает получение частиц определенного заданного размера с незначительной дисперсией беэ этапа их сепарации, что в значительной ст .— пени облегчает процесс получения микроносителей. Этот прием позволяет получить микроносители, не применяя этапа суепензионной полимеризации гидрофильных материалов в гидрофобной среде реакции, что в значительной степени ускоряет получение микроносителей с одновременным улучшением их качеств, например для получения гранулированных микроносителей способом суспензионной полимеризации требуется применение дорогостоящего оборудования (ферментеры), гидрофобной реакицонной смеси(по известнсму способу — 3-компонентная смесь), сформировавшиеся частицы необходимс освобождать от компонентов реакцион— ной смеси путем промывки в органических растворителях и растворах детергентов, полученные способом суспензионной полимеризации частицы неизбежно имеют вкрапления. реакционной среды, что ухудшает качество микроносителей. Предлагаемый способ свободен от перечисленных недостаков.

Пример 1. Приготовление микроносителей.

Смешивают 400 мл 25%-ного водйогд раствора желатина, полученного при

50 С, со 150 мл 25% †но водного раствора глиоксаля и интенсивно перемешивают при комнатной температуре

1 мин. Через 10 мин блок желатинового геля продавливают через сито с диаметром отверстий 250 мкм. Полученные частицы (диаметром не более

250 мкм) обрабатывают 0,25%-ным раствором трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе (шБ), рН 7,б,в течение 10 мин в соотношении 550 г частиц геля/0,5 л раствора трипсина при комнатной температуре и постоянном перемешивании. После этого частицы геля промывают 0,15 M раствором NaC1 для удаления трипсина и растворимых продуктов ферментативного расщепления желатинового геля. К отмытым часгицам добавляют 100 мл 25%-ного раствора глиоксаля и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор глиоксаля фильтрацией на сите с диаметром отверстий 100 мкм частицы суспензируют в 1 л 3%-ного водного раствора перекиси водорода и выдерживают так 30 мин, после чего микроносители промывают раствором

0,15 М 11аС1. Суспендированные в

0,15 М растворе Na01 микроносители стерилизуют автоклавированием при

О

120 С в .течение 15 мин.

П р и м с р 2. !приготовление микроносителей.

Смешивают 200 мл 35%-ного водного раствора желатина, полученного при о

50 С, с 700 мл 25%-ного водного раст-, вора глутарового альдегида и интенсивно перемешивают при комнатной температуре 1 мин. Через 10 мин блок желатинового геля продавливают через сито с диаметром отверстий 200 мкм.

Полученные частицы диаметром не более 200 мкм обрабатывают 0,5%-ным раствором коллагенаэы в 0,15 М ФБ в течение двух минут, при соотношении

270 г частиц геля/230 мл раствора коллагеназы при 37+1 С и постоянном перемешивании. Затем частицы промывают 0,15 М раствором МаС1. Отмытые частицы обрабатывают последовательио в 130 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида — 10 мин при комнатной температуре., 0,15 М раствором

NaC1 для удаления непрореагировавшего сшивающего агента, в 0,5 л

2%-ного раствора боргидрата натрия

30 мин при комнатной температуре, обильно промывают водой до нейтраль13? 1 748 ной рН промывной жидкости ° После этого микроносители ресуспендируют в

0,5 л 0,15 М раствора NaCl,÷åðeç

10-15 мин промывают свежей порцией изотонического раствора NaC1 и стео рилизуют автоклавированием при 120 С в течение 15 мин.

Пример 3. Приготовление микроносителей.

Микроносители получают так же, как10 в примере 2, но используют 203-ный раствор желатина, в качестве протеолитического агента — 0,757-ный раствор химотрипсина, в качестве во".становителя — 37-ный раствор Н О . f5

Пример 4. Желатиновый гель, полученный по примеру 1 (1 л), обрабатьгвают 0,75 л 0,25Х-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение 10 мин о при 25 С и при постоянном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру 1 и получают л микроносителя.

При выращивании клеток почек зеленых мартышек (КПЗМ) по примеру 5 их концентрация через 4-5 сут достигает

l 5+0,2 млн/мл, возрастая в 10 раз.

Пример 5. Желатиновый гель, полученный по примеру (1 л), обрабатывают 1,25 0,757.-ным раствором химотрипсина в 0,06 М фосфатном буфере, рН 6,4, в течение 12 мин при 20 С и при постоянном перемешивании. Гель

J5 далее обрабатывают по примеру 1 и получают 1 л микроносителя. При выращивании клеток КПЗМ по примеру 5 их концентрация через 4-5 сут достигает 1,5 0,2 млн/мл, возрастая в 4D среднем в 10 раз.

Микроносители, изготовленные согласно описанию, приведенному в примерах 1-5, имеют практически одинаковые свойства; они представляют собой 45 механически, химически и термически стойкие частицы необходимого диаметра например, 100-250 мкм из поперечносшитого денатурированного коллагена, обеспечивающего биоспецифическое взаимодействие с клетками.

Частицы микроносителей, полученных согласно описанию, приведенному в примерах 1-5, имеют овальную форму, гладкую поверхность, отлично подходя-55 .щую для прикрепления, распластывания и роста клеток, удельный вес и коэффициент преломления света, примерно равные таковым у воды,и могут с равным успехом быть применены для вырашивания клеток различных тштон.

П р и и е р б. Выращивание первичньгх клеток куриных эмбрионов на разработанных микроносителях.

18 мл плотного осадка микроносителей, обеспечивающих культуральную площадь около 5000 см, суспендируют в 50 мл соленого раствора Хенкса.

Через 10 мин солевой раствор Хенкса сливают, а микроносители ресуспендируют в 50 мл питательной среды 199 с 5,, сыворотки телят, 0,257 гидролизата лактальбумина, 0,17 галактозы, 20 мМ буфера НГРЕS и антибиотиками, и суспеггзгпо переносят во флакогг объемом 250 мл с подвешенной мешалкой (спиннер) . Е суспензии микроносителей добавляют 50 мл первичных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста (клетки суспендируют в среде указан«ого состава) и во флакон добавляют питательную среду до объема 100 мл.

При этом посевная концентрация клеток составляет 0,5 млн/мл, а концентрация микроносителей обеспечивает культуральную площадь около 50 см /мл, о

Культивирование проводят при 37 С и плагзном перемешивании суспензии микроносителей: в первые сутки культи— вирования со скоростью 10 об/мпн, во вторые и третьи — 20 об/мин, а далее 50 — 60 об/мин. Начиная со вторых суток культивирования, ежесуточно проводят замечу части среды: на вторые и третьи сутки — 507. объема среды, далее 707 объема среды. Спустя 5-6 сут после начала культивирования, на частицах микроносителей формируются сливные культуры первичных клеток куриных эмбрионов. Плотность культур к концу срока культивирования (6 сут) достигает 5,8 0,3 млн. кл/мл, т.е. число первичных клеток куриных эмбрионов возрастает в

1l раз за 6 суток.

Подсчет числа клеток, выросших на микроносителях, проводят по следующей методике. После окончания куль- . тивирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендируют микроносители), После оседания микроносителей в пробе надосадочную жидкость сливают, а культуры на микроносителях несколько раз промывают

0,15 М фБР. Культуры на микроносителях обрабатывают по методу подсчета ядер клеток.

1321748

Пример 7. Выращивание вторич" ньгх клеток почек зеленых мартьппек на разработанных микроносителях.

Вторичные клетки почек зеленых мартышек КПЗМ вносят в концентрации

2 ° 10 кл/мл в суспензию разработанных микроносителей, которые используют в концентрации 5,5 мл плотного осадка на 100 мл среды, что обеспечивает культуральную площадь около

15 см /мл. Применяют питательную cpe-2 ду следующего состава: максимальная среда Игла (МЗМ) с 10% сыворотки телят, 0,257. гидролизата лактальбумина, 0,1% галактозы, 20 мМ буфера

НЕРЕЯ и антибиотиками. 350 мл суспензии микроносителей и клеток в питательной среде вносят в спиннер объемом 1 л. Культивирование провоо дят при 37 С и плавном перемешиьании суспензии: !О об/мин — первые сутки !мешалку включают на минуту через каждые 40 мин в течение 6 - после засева клеток, затем мешалка работает постоянно1, 20 об/мин — вторые и третьи сутки культивирования и далее

50 — 60 об/мин. Через 72 ч и через !

20 ч после начала культивирования проводят замену соответственно 30 и

707 среды на свежую. Через б сут культивирования почти на всех частицах микроносителей наблюдают плотные культуры"клеток. К этому времени кон-центрация клеток достигает 3,,8 млн/мл

Пример 8. Длительное культивирование клеток HG разработанных микроносителях.

Вторичные КПЗМ выращивают так же, как в примере 7. После формирования плотных культур микроносители переносят в роллерные бутыли объемом 0,5 л, внутренние стенки которых предварительно силиконизируют.

В каждую бутыль внося" по 175 мл суспензии микроносителей с выросшими культурами. Культивирование процолжают при 37 С при 10 об/мин, в среде такого же состава, как описано в примере 5, но с пониженной до 37 концентрацией сыворотки. Дважды в неделю заменяют 507 среды на свежую. Еженедельно проводят подсчет клеток по методике, указанной в примере 6, и микроскопирование взятых образцов культур на микроносителях,. Наблюдение показывает, что клетки на протяжении 9 недель (срок наблюдения) остаются прозрачными, сохраняют четПример 10. Выращивание клеток циплоидной линии на разработанных микроносителях. ! . 0 Динлоидные клетки М вЂ” 21, полученной из тканей эмбриона человека, выращивают на разработанных микроносителях так же, как в примере 7, с той разницей, что посевная концентрация

- клеток в данном случае составляет

Э.>

3 10 кл/мл. Через 4 сут культивирования количество клеток достигает

1,8 млн/мл, т .е . во=- растает в 6 раз за 96 ч, при э:ом большая часть час1О и

10 кие границы и типичную для них форму, не отслаиваются от микроносителей.

Число клеток на протяжении всего времени наблюдения сохраняется на уровне (3,6+!1,36) млн/мл.

П р и M е р 9. Выращивание клеток перевиваемой линии ча разработанных микроносителях в среде с обычной и с пониженной концентрацией сыворотки.

На разработанных микроносителях, взятых в концентрации 5,5 мл плотного осадка (100 мл среды 15 см /мл), выращивают клетки линии 4647, полученной из почек здоровой взрослой мартьпл<и. Посевная концентрация клеток линии 4647 составляет 15 10 кл/

/мл. Используют питательную среду такого же состава, как в примере 7, но в одном случае среда содержит 10% сыворотки, а в другом — 17. сыворотки телят. В обоих случаях в среды добавляли пируват Ма до концентрации

10 мМ и метилцеллюлозу до конечной концентрации 0,3%. Для равнения такие же культуры клеток выращивают на поверхности стеклянных плоскодонных флаконов объемом 0,1 л. Посевная плотность культур клеток во флаконах такая же, как и в культуре на микроносителях: 10 1О /см . При кульЭ тивировании клеток в средах с обычной и пониженной концентрацией сыворотки обычными методами (на стеклянной поверхности) и на разработанных микроносителях (коллагеновый субстрат)показано, что при всех прочих равных условиях урожай клеток, выращенных на. поверхности стекла при использовании питательной среды с 107. сыворотки, составляет 80,27, а при использовании среды с 17 сыворотки достигает 42,27 от урожая клеток, выращенных на разработанных микроносителях.

13217

Составитель В.Муронец

Редактор Н.Егорова Техред Л.Олийнык Корректор А.Тяско

Заказ 2723/19 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открьггий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.ужгород, ул. Проектная, 4 тиц микроносителей покрыта сливным

1 слоем клеток.

Пример ll ° Сбор клеток, выращенньгх на разработанных микроносителях. 5

Первичные клетки эмбрионов выращивают так же, как в примере 6. После окончания культивирования отбирают пробу 10 мл (предварительно тщательно суспендировав микроносители) и про-!О водят подсчет клеток, как в примере

6 ° Подсчет клеток показывает, что их концентрация достигает 5,7 млн/мл.

Остальные микроносители после отмывки от питательной среды ресуспенди- !5 руют в 50 0,15 М и ФБР, содержащего 0,253 трипсина и 0,02 7 ЭДТА.

Через 5 мин надосадочную жидкость осторожно сливают, микроносители с клетками инкубируют в оставшемся ко- 20 личестве диспергирующего раствора в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого к суспензии микроносителей добавляют ФБР с 0,5Е гидролизата лактальбумина и флакон 25 несколько раз энергично встряхивают.

Отслоившиеся от микроносителей клетки подсчитывают с помощью гемоцитометра (камера Фукс-Розенталя). Количество клеток при этом составляет 30

5,25 млн/мл.

Пример 12. Желатиновый гель, и лученный по примеру 1 (1 л), обрабатывают 0,6 л 0,20Х-ного раствора трипсина в 0,15 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение 10 о

10 мин при 25 С и постепенном перемешивании. Гель далее обрабатывают по примеру !. При выращивании клеток

КПЗМ по примеру 5 на полученном геле 40 концентрация клеток через 4-5 сут достигает 0,17 0,02 млн/мл, возрастая в 1,1 раза, т.е. рост практически не наблюдается.

Пример 13. Желатиновый гель, 45 полученный по примеру 1 (! л), об48 8 рабатыва;т 1,5 л 1Е-ного раствора трипсина в О,!5 М фосфатном буферном растворе, рН 7,6, в течение

1О мин при 5 С и постоянном перемео шивании. Во время обработки желатиновый гель полностью растворяется и получить микроноситель не удается.

Таким образом, улучшение качества предлагаемого микроносителя по сравнению с микроносителем, получаемьм по известному способу, достигается более высокой чистотой продукта, получаемого по предлагаемому способу: в этом микроносителе отсутствуют примеси среды поликонденсации (масла, углеводородов) . Частицы мик роносителя,получаемые методом дис.персионной поликонденсации,содержат примеси реакционной среды, которая в дальнейшем оказывает токсическое воздействие на клетки. Улучшение качества микроносителя, получаемого по предлагаемому способу, достигается также тем, что предлагаемый способ обеспечивает более высокую однородность фракционного состава микроносителя (987. частиц с размерами 180200 мкм). Микроноситель, получаемый по известному способу, является менее однородным (75-80Е частиц с размерами 100-250 мкм).

Кроме того, частицы, полученные предлагаемым способом, имеют более однородный состав, так как их размер определяется диаметром отверстия сита, через которое продавливают гель. Во всех известных способах необходима стадия фракционирования частиц по размерам, при которой отход гранул геля составляет 70-ЯОЕ. Следовательно, предлагаемый способ коренным образом изменяет технологию получения микроносителей и позволяет получить высококачественный и более дешевый продукт, причем с более высоким выходом.