Способ анализа антигенов

 

Изобретение относится к способам анализа антигенов, предназначено для диагностики инфекционных заболеваний, стандартизации вирусных препаратов, контроля загрязнения окружающей среды и для научных исследований (серотинирование выявляемых штаммов, изучение структуры антигенных детерминант). Цель изобретения - упрощение способа. Для этого культуру стафилококка щтамм Cowan 1 осаждают центрифугированием при 3000 g 15 мин, ресуспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), взвесь бактерий фиксируют 0,3-З /о-ным раствором формальдегида 0,5-3 ч. Стафилококк 3-4 раза отмывают в ФСБ от формальдегида и прогревают 1 ч при 80°С для снижения протеолитической активности, затем суспензию вновь отмывают в ФСБ и доводят до 10%-ной концентрации. При длительном хранении во взвесь стафилококка добавляют мертиолят натрия или азид натрия в конечной концентрации 1:1000- 1:1000й Выявление антигенов осуществляют визуально по реакции агглютинации. САЗ to 00 со 05

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 G 01 N 33/53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВЧ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4026400/28-14 (22) 20.02.86 (46) 15.07.87. Бюл. № 26 (7l) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (72) В. И. Хаустов, Л. А.. Шекоян, С. Г. Дроздов и М. Б. Королев (53) 615.373 (088.8) (56) Дзантиев Б. Б., Егоров А. М. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. — Журнал

ВХО им. Менделеева. т. 27, № 4, с. 82 — 89. (54) СПОСОБ АНАЛИЗА АНТИГЕНОВ (57) Изобретение относится к способам анализа актигенов, предназначено для диагностики инфекционных заболеваний, стандартизации вирусных препаратов, контроля загрязнения окружающей среды и для научных ис„„Я0„„1323960 А 1 следований (серотинированне выявляемых штаммов, изучение структуры антигенных детерминант) . Цель изобретения — упрощение способа. Для этого культуру стафилококка штамм Cowan 1 осаждают центрифугированием при 3000 g 15 мин, ресуспендируют осадок в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), взвесь бактерий фиксируют 0,3 — 3%-ным раствором форм альдегида 0,5 — 3 ч. Стафилококк 3 — 4 раза отмывают в ФСБ от формальдегида и прогревают 1 ч при 80 С для снижения протеолитической активности, затем суспензию вновь отмывают в ФСБ и доводят до 10%-ной концентрации. При длительном хранении во взвесь стафилококка добавляют мертиолят натрия или азид натрия в конечной концентрации 1:1000 в 1:10004

Выявление антигенов осуществляют визуально по реакции агглютинации.

1323960

Изобретение относится к способам анализа антигенов и может быть применено в практике здравоохранения для диагностики инфекционных заболеваний, стандартизации вирусных препаратов, контроля загрязнения окружающей среды, а также в научных целях (серотипирование выявляемых штаммов, изучение структуры антигенных детерминант и т. д.).

Цель изобретения — упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Стафилококковый реагент готовят заблаговременно или непосредственно перед проведением анализа. Культуру стафилококка штамм Cowan 1, выращенную в течение

12 — 18 ч, осаждают центрифугированием при 3000 об/мин 15 мин и дважды отмывают от питательной среды в 0,01 М фосфатносолевом буфере (ФСБ). Эти и все последующие процедуры отмывания стафилококка осуществляют путем осаждения бактерий при 3000 об/мин 15 мин и ресуспендирования осадка в ФСБ. Затем взвесь бактерий фиксируют раствором формальдегида в концентрации от 0,3 до 3 /о в течение 0,5 — 3 ч.

Фиксацию ведут при постоянном перемешивании. Затем стафилококк 3 — 4 раза отмывают в ФСБ от формальдегида и прогревают 1 час при 80 С для снижения протеолитической активности, после чего суспензию отмывают еще раз в ФСБ и доводят до

10 /о-ной концентрации. При необходимости длительного хранения во взвесь стафилококка добавляют мертиолят натрия или азид натрия в конечной концентрации

1:1000 — 1:10000.

Для приготовления стафилококкового реагента можно также использовать лиофилизированный препарат стафилококка

Ленинградского института им. Пастера..Его регидратируют в дистиллированной воде, 1 — 2 раза отмывают в ФСБ и доводят до

10о/о-ной концентрации.

С целью упрощения регистрации анализов суспензию стафилококка перед сенсибилизацией специфической сывороткой окрашивают метиленовым синим. К 1 мл 10/о-ной суспензии добавляют О,1 мл красителя, разве денного ФСБ 1:100. Окрашенные бактерии позволяют учитывать результаты при обычном (падающем или проходящем) освещении на светлом фоне, тогда как и при использовании неокрашенных требуется осветитель для создания условий, приближающихся к полному внутреннему отражению, а наподбор этих условий уходит дополнительное время.

Сенсибилизацию стафилококка проводят следующим образом.

К 0,2 — 0,3 мл гипериммунной сыворотки против ротавирусов, не содержащей антител, к стафилококку и разве>1енной ФСБ

1: !00 "добавляют 0,5 — 1 мл 10 /о-ной взвеси

c1афилококка, обработанного указан;.ым способом, тщательно перемешивают и через 15 — 30 мин после однократного, отмывания в ФСБ и осаждения центрифугирова5 нием при 3000 об/мин в течение 15 мин (либо при 10000 об/мин 30 с) добавляют 10 мл

0,01 N ФСБ с 0 05о/0 твин 20 и 0 5о/о — о/о Но. го бычьего сывороточно-о альбумина.

Ha;îé фазы, .ïîñîáной сорбировать антитела (микротитрационные полимерные панели с U -образными лунками, полимерные пробирки и т.п.), наносят раствор специфической гипериммунной сыворотки, выдерживают 2 — 3 ч для адсорбции антител при 37 С на твердой ! 5 фазе. Несвязавшиеся антитела удаляют промыванием. В качестве промывочно"o раствора можно использовать 0,05 — 0,01 М

ФСБ (рН 7,2 — 7,4) или григотовленные нa этом буфере 0,05 — 0,5 /0-ные растворы поверхностно- активных веществ (т вин 20, ОП вЂ” 7 и т.n.), 1о/o-пый раствор бычьего сывороточного альбу>:и на. После этого к сорбированным на твердой фазе антителам добавляют раствор исследуемого антигена.

Время образования комплексов антиген25 антитело при 37 С составляет 1 — 2 ч. Несвязавшийся антиген и co»yòствующие примеси удаляют трехкратным (2 — 3 мин} промыванием указанным буфером.

После этого добавляют готовый стафилококковый реагент. Время контакта стафилококкового реагента 1 — 2 часа при 37 С с последующим помещением на хс>лод при

+4 С. Результаты реакции учитывают визуально через 3 — 5 ч после внесения реагента или на следующий день.

Реакцию учитываюг следующим образом.

4+ — резко положительная реакция: агглютинированные бактерии образук>т перевернутый «зонтик», края которого опадают.

3+ — положительная реакция: агглюти40 нированные бак герии образуют перевернутый «зонтик» с ровными краями.

2+ — слабо положительная реакция: на дне лунки наряду с «nîíòèêoM» намечается образование диска из неагглютинированных бактерий.

f+ †сомнительн реакция: по периферии образовавшегося диска из неагглютинированпых оак I ерии Hp.anачительная зона из аггл!Отини—

50 рованных бактериальных к.еток..

" — " -отрицательная реакция: бактерия полностью оседает на дно лунки в виде диска.

Сыворотки, используем ые в предлагаемом способе, не должнь> содержать антител к стафилококку. Для э гого проводят контроль путем смешивания на предметном стекле по 1 капле сыворотки и 10"/о-ной суспензии стафилококка. Если через

1323960

3 — 5 мин не происходит образования агглютинатов, сыворотку считают пригодной.

Пример 1. Анализ антигена ротавирусов в культуре клеток. Стафилококковый реагент готовят непосредственно перед проведением анализа из 10 /О-ной суспензии стафилококка, как описано.

В полистирольную панель с U -образными лунками вносят по 75 мкл гипериммунной сыворотки, разведенной 0,01 М ФСБ

1:2000. Титр гипериммунной сыворотки морской свинки, иммунизированной ротавирусом, в реакции торможения гемагглютинации равен 1:2560. В контрольные лунки вносят по 75 мкл нормальной сыворотки, не содержащей антител к ротавирусам, в тех же разведениях. Панели инкубируют при

37 С 2 — 3 ч. Несорбированные антитела удаляют из лунок постукиванием панели по фильтровальной бумаге лунками вниз. Лунки панели трижды промывают 0,01 M ФСБ с 0,05О/о твин 20 (контакт 2 — 3 мин). После этого в лунки вносят по 50 мкл раствора исследуемых ротавирусных антигенов в серийных двухкратных разведениях. Антигены — эта лизаты клеточных культур, зараженных ротавирусами. Параллельно вносят по 50 мкл для контроля в серийных двукратных разведениях .лизаты незараженных клеток. Панель с антигенами инкубируют

1 — 2 ч при 37 С . Несвязавшиеся антигены и посторонние примеси удаляют четырехкратным промыванием 0,01 М ФСБ с 0,05О/о твин 20. Затем в каждую лунку вносят по

50 мкл 0,5О/р-ной взвеси стафилококкового реагента. Панели выдерживают 1 — 2 ч при

37 С с последующим помещением на холод при +4 С. Учет реакции производят через

3 — 5 ч или на следующий день после внесения реагента. Титром антигена считают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию бактерий на 2+. Результаты анализа определяют визуально.

Параллельно определяют титры исследуемых антигенов известным способом

И ФА.

Пример 2. Анализ ротавирусных антигенов в фокальных экстрактах больных ост рым гастроэнтеритом. Анализ проводят как описано в примере l. Для исследования на наличие антигенов ротавируса берут 10—

20О/о на 0,01 М ФСБ фокальные суспензии больных гастроэнтеритом. Для контроля используют суспензии фекалий, не содержащих ротавирусных антигенов. Результаты анализов учитывают визуально. Положительной считают реакцию агглютинации стафилококка на 2+ и более. Всего исследовано

107 образцов.

Пример 3. Типирование культуральных антигенов ротавируса человека. Анализ проводят,как описано в примере 1. Для исследования берут лизаты клеток культуры ткани после трехкратного замораживания и оттаивания. Для контроля используют полученные таким же образом культуральные антигены ротавируса обезьян и ротавируса свиньи. Гипериммунные сыворотки морских свинок (серии 27. 28 и 310), полученные к трем вариантам ротавируса чезовека 1836, Л 5 и IA, используют для се» сибилизации панелей и стафилококка в разведениях 1:3000. Положительной считаю реакцию агглютинации на 2+ и более.

Пример 4. Титрование антигенов вируса полиомиелита 1, II, 111 типов. Анализ р >водят,как описано в примере i. Для исследования берут культуральные антигены вируса полиомиелита I типа штамм Магоней, Ц типа штамм Смирнов, III типа штамм

Саукет и моновалентные диагностические коммерческие сыворотки с рабочим р.:зведением для реакции нейтрализации 1:20;

1:40; 1:40 соответственно для каждого типа.

В предлагаемом способе сыворотки каждого типа используют в разведении 1:1000 для сенсибилизации панелей и стафилококка. В качестве контроля антигенов берут лизаты незараженных клеточных культур в тех же разведениях.

Результаты анализа определяют визуально. Титром анти гена считают наибольшее его разведение, которое вызывает агглютинацию стафилококка на 2+: для типа

1 — 1:64, для типа 1 — 1:32 и для типа

111 — 1: 16.

Пример 5. Анализ антигена вируса гепатита А. Анализ проводят как в примере 1.

Для исследования берут культуральный антиген вируса гепатита А в двухкратных серийных разведениях 1:25 — 1:1600. Для сенсибилизации панелей и стафилококка используют 1 gG в разведении 1:100. В качестве контролей берут лизат незараженной культуры клеток. Титр антигена, определяемый визуально предлагаемым способом, равнялся 1:400. При исследовании этого же антигена в ИФА титр равнялся 1:1600.

Использование в предлагаемом способе стафилококка исключает применение дефиUHTHblx реактивов: высокоочищенной и высокоактивной пероксидазы хрена, хромогенного субстрата, состоящего из ортофенилендиамина, лимонной кислоты и перекиси водорода, реактивов и специального оборудования, необходимых для конъюгации фермента с IgG. Замена фермента исключает наиболее сложную и нестандартную операцию по проведению хромогенной реакции.

Предлагаемый способ позволяет использовать специфические сыворотки, не выделяя из последних IgG. В ИФА для получения конъюгата используют очищенный IgG.

Быстрота приготовления реагента (15—

30 мин) из фиксированного стафилококка расширяет диапазон диагностических возможностей способа. Приготовление конъюгата в ИФА занимает 3 сут.

1323960

Фсри ула изобретения

Сс ста-- :uåëü В..г!итовченко

Редактор Е. Конча Техред Yi. Верее Корректор В. Ьутяга

Заказ 2960 49 Тираж 776 Подписное

В!!ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий ! !3035, Москва, Ж вЂ” 35, Рауеискаи наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. УжгоРод, ул. Г!рсектная, 4

Окрашивание стафилококка метнленовым синим упрощает регистрацию анализа, так как позволяет оценивать результат при обычном освещении на светлом фоне. тогда как jlJIB учета агглютинации неокрашенных бактерий требуется осветитель для создания условий, приближающихся к олнсму внутреннему отражению, а на подбор зтих условий уходит дополнительное время.

Использование лиофилизированного стафилоко ка, сенсибилизированного специфИЧЕСКИМИ CblBOPOTKHMH ПОЗВОЛЯЕT нять предлагаемый способ в любой клинической лаборатории и даже в полевых условиях.

Предлагаемый способ анализа антигенов может найти широкое применени" в различных ООластях здpBВООхпанения, биОлОгни, ветеринарии, сельского хозяйства.

Способ анализа антигеH08 путем «несения исследуемого образца к специфичсским антите. lB i. сорбированнь»м HB твердой фазе с последующим дОбавлением BTopичных специфических антител и выявлением антигенов, отлинагои!ийся тем, что, с целью vfipoщения анализа. перед добавлением специфических вторичцых антител их предварительно связывают с протеином А staphytococus aureus штамма Cowau 1, при этом бактерии окрашивают водорастворимым красителем и выявление антигенов осуществляK T визуально по реакции агглютинации ба llTCpHH.