Способ определения качества спермиев

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„) 329780

1>(! 4 3 (i l I) (l", 3 (> I 13 I(11)(!

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ !(, t t>((< (((l>((< и<, ((>;((Р + (1(ll(и (j),13 иР< >),1)< )31, lt И(>(,1(,(> H)l l(lt fl I Н;(,Ви:3 ()КР(! Н(tt ((t>t >, Е (>(Рчиев ll<> (м!Икр!> h()tt() t. 13 к;1 t(. <:3(3» <1>)(3<>р<>

; Рич;1 ll((t() I ü â í) t (÷ å(ü (в37). к Р;1 111(. I((t

f I((till(I(>l3()l(> кр;1«и<)го и ти.(иi t <>р,»(иЬИt.

I1ри tt()t3I)(ж,в нии, меч()р(ии,(;!кр<>« )3(1,! ти(f1 кР(lе((t>(tt ((I)<) (f1(v(I(Г В !(к Р()(< > (13 и Bt>t 31(в;1(т е((!33 вени<..;1 - ти,(иу (l>lн>3(и (. !

I I>< >Bit кilH иеР(. В и()ВР(. ж, ((н tt> н> ((и Г()ll. i fl <в 1;! ГИ И(ЕК3 Н) 31("1()Р()Н (((LР (IIH, ВЬ! <Ь(и;13 (t3(I <. lilt((. (() Г< к(И(3 klt (,(I(РЧ Ч c i! ((Ill((3;(Н ) I е нfl! ;! Ге,lьн )lt ер(.(иЙ, е()1ерж;!1цеЙ (!>.13ор()xр()31 нри е1е (н)и(е31 соотtt()(((LE((((i к<)3(и(>и(и(о(3 1;!е.,„: 1 и;«ииовь(и р;)ень(Й И.()1),3 (),()1 ); -> ((i (иуч <)р<>чи (() ()()()5 (),()((), н е,(ьи;!)l ере.(;l нег;).(ьи<>е (1 к;(и(е I li<. < Il(I)

%f (t(i3 (l H ll() ll (iT(Ih. (t (3(1()(! ll ll) (l3(I(f1l1H

ll() (. I B))1(((1((((<. ll I l! ь!" 1 )1(t hð(>еh() t(<)(l I I;)(). I. ()1) 4и.356!)7 :3()- I;) (22) 2) !.() 3.86 (46) 15.()8.87. 1)н)л.,Ч 3() (71) Ч кр;IинскиЙ н;1 I!I(>-иее,((.(ив;1!е.(ь(киЙ

И НЕТИТ> Т (IT(1 (!ЕB<). (eTB(t (72) 3. I3 T(р(tt((ttê<>, 11. I l (.;1 ;и(киЙ и 3. Г) .. )РТ(чеtlh() (5, 3) 5!)1. !(>3. I:;543 ()t> l ()88.8) (56) )вт<>рек(к Bfi;I(г«льет(3<> (:(,(,Р ,Ч(345!)1!), к,1..А 61 1) 7,()), 1!(71.

:"3вг<>р(к<к еви ((1(.(ü TB() <.(.(,1 ,Ч l()titi5)), кгк Л 61 13 1(), ()(), 1 .)8" (,>4) (:I I()(:()Ii (1(1 РI ..1I;, Il .l!1!Я I<:, ((II .(71 13. 3 (.!11 РЧ! !1:.13 (57) !!з(><>р(г(lift(<>Ill<>(и((H к <>и<>,l(>l ии р;13 (< но к ill()l /к И(3<)(н(,1 i. 11(.(ьн> и 3()<)1)(1(ill()l

)(В Л и (1 (H l I () (31 1(I I (l l f ((I < ) I l l () (Г l l (Н < ) (() < ) 1 (. .I l < >(u 1 > В к ) 1 и ) (; 1 е I (xl (((((((till! (((е I 1 <. I > 3(t )t (I it 1 t I О

М сО 4

Оо (0

1329780

Интенсивность свечения поврежденных спермиев, баллы

Концент рация этидиум бромида мас.7

Концентрация тиазинового красного, мас.X

1 0 002 0 003 0 005 0 006 0 008 0 010 0 012 оо )

0,015 0,020

0,0003 2

0,0004 2

0,0005 3

0,0008 3

0,0010 3

0,0015 3

0,0020 3

0,0025 3

0,0035 3

2 2

Изобретение относится к биологии размножения животных и предназначено для лабораторных и клинических исследований в области криобиологии, ветеринарии и медицины.

Целью изобретения является повышение точности определения.

При.чер. В питательную среду вводят тиазиновый красный и этидиум бромид в количестве 0.006 и 0,001 мас.%: соответствено. Затем отмеривают в пробирку в соотношении 1:10 сперму и питательную среду, содержагцук флуорохром (например 0,01 мл спермы и 0.1 мл среды), тщательно перемешивают, наносят на предметное стекло каплю смеси и плотно накрывают покровным стеклом так, чтобы движение спермиев было ограничено. После этого препарат помещают под люминесцентный микроскоп (МЛ-2 или МЛ-3) . При этом используют возбуждающий свет с длиной волны 365 нм, а флуоресценцик наблюдают в области 500 700 нм. Препарат рассматривак т под иммерсией при увеличении не менее 90Х 15 в отраженном свете. В поле зрения учитывают число (процент) поврежденных и нормальHbIx сперм иев. Г1ри этом на темно-синем фоне четко просматриваются более светлые спермии, которые относят к нормальным (акросома нормальных спермиев несколько темнее головки, но светлее фона). При повреждении акросомы, когда нарушена проницаемость ее мембраны, тиазиновый красный, проникая внхтрь акросомы, вызывает ее светло-cалатное свечение. Г1ри более глубоком повреждении акросомы, сопровождающемся нарушением ее морфологического строения, чаще всего приобретением шаровидной формы, тиазиновый красный вызывает ее интенсивное ярко-малиновое свече5 ние. 11ри повреждениях цитоплазматической мембраны сперм иев этидиум бром ид проникает в клетку и, связываясь с ДНК, вызывает ярко-малиновое свечение головки сперм ия.

Оптимальное соотношение в смеси тиазинового красного и этидиум бромида определяк>т следующим образом. В питательную среду (разбавитель спермы петухов ЛКС-1) вводят различные навески красителей, а также детергент дигитанин в конечной кон15 центрации 1 мМ с целью повреждения у всех спермиев мембран головок и акросом

РезульTàTû исследований представлены в таблице.

Для удобства учета интенсивности свечения поврежденных органелл спермиев при применении той или иной концентрации красителей в таблице приведена характеристика по 5-балльной шкале, где 5 баллов отражают наиболее интенсивное свечение по врежденных акросомы и головки спермия;

25 4 балла — интенсивное свечение одной поврежденной органеллы (например акросомы) и менее интенсивное, но еще четко различимое свечение другой (например головки); 3 балла — недостаточно интенсивное свечение головки и акросомы или же достаточно интенсивное свечение одной органеллы при еле различимом свечении другой;

2 балла — — слабое свечение головки и акросомы; 1 балл — еле различимое свечение с перм не в.

1329780

Формула изобретения

Составитель Л.филиппова

Редактор И. Рыбченко Техред И. Верес Корректор М. 1Пароши

Заказ 3511j8 Тираж 595 Iloдписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по я лая изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35. Раушская наб, д. 4i5

Производственно-полиграфическое предприятие. г. Ужгород, ул. Проектная. 4

Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что тиазоновый красный и этидиум бромид можно эффективно использовать в смеси в довольно широких п редел а х (0,003 — 0,012 м ас.% и 0,0005—

0,002 мас.% соответственно). При этом оптимальная концентрация тиазинового красного в данной смеси составляет 0,005—

0,008 мас.%, а этидиум бромида — 0,0008—

0,0015 мас.%. Недостаточная концентрация красителей (или одного из них) в смеси, т.е. меньше нижнего предела, не обеспечивает четкой дифференциации структур спермия в связи со слабым свечением, а избыток (выше верхнего предела) приводит к увеличению интенсивности фонового свечения, что затрудняет наблюдение. Избыток одного красителя (например тиазинового красного ) маскирует люминесценцию другого (этидиум бром ида), введенного в недостаточной концентрации.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет при необходимости дифференцировать в препарате спермии на нормальные (несветяшиеся темно-синяя головка и акросома); с нормальной головкой (несветящаяся, темно-синяя) и поврежденной акросомой (светло-салатное или ярко-малиновое свечение); с поврежденной головкой (яркомалиновое свечение) и неповрежденной акросомой (несветягцаяся, темно-синяя): с поврежденной головкой и поврежденной акросомой (светягцаяся светло-салатная акросома и ярко-малиновая головка или же ярко-малиновое свечение акросомы и головки); с нормальной головкой (несветягцаяся, темно-синяя) и отсутствием акросомы; с поврежденной головкой (ярко-малиновое свечение) и отсутствием акросомы;

5 отдельно расположенные друг от друга светягциеся органеллы спермия (акросома, I пловка, хвостик).

3анная дифференциация спермиев лает возможность более точно установить. а затем и устранить причину тех или иных повреждений. Это особенно важно при разработке режимов замораживания и оттаивания спермы, изучения токсичности криопротекторов, разработке сред для хранения и замораживания спермы, режимов эксплуатации самцов, в клинической практике и т.д.

Способ определения качества спермиев, включающий смешивание спермы с питательной средой, в которую вводят флуорохром этидиум бромид, и последующий анализ окрашенных спермиев под микроскопом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в питательную среду дополнитель»о вводят флуорохром тиазиновый красный при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Флуорохром тиазиновый красный 0,003 — 0,012

Флуорохром этидиум бромид 0,0005 — 0,002

Питательная среда Остальное а о качестве спермиев судят по повреждению их головки и акросомы.