Способ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот в биологическом материале

 

Изобретение относится к биологии и медицине, и предназначено для определения фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК). Цель изобретения - ускорение способа за счет одновременной экстракции определяемых веществ и определения ИХ содержания в одном образце. Для этого проводят экстракцию липидов смесью этанол-диэтиловьй эфир (1:1) в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют к образцу азотнокислый или сернокислый кадмий в концентрации 10 мМ при рН 8,0. Разделение фаз проводят , добавляя воду и диэтиловый эфир так, чтобы конечное соотношение было вода:спирт:эфир - 2:1:2. Верхнюю фазу отбирают, дополнительно экстрагируют водно-спиртовую фазу пентаном в соотношении 2:1:2, верхнюю фазу отбирают и приливают к первому экстракту и смесь экстрактов центрифугируют при 3000-5000 g 20 мин. Затем верхнюю фазу отбирают, приливают к ней по 0,1 об.ч. спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха. Затем формируют тонкую пленку липидов на угольной подложке, регистрируют рентгеновскую флуоресценцию и рассчитывают содержание фосфолипидов и СЖК по интенсивности рентгеновского излучения фосфора и кадмия , используя предварительно построенную теоретическую кривую. 2 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУ БЛИН

SU 133222 (51)4 G 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3737920/28-14 (22) I1.05.84 (46) 23.08.87, Бюл. ¹ 31 (71) Научно-исследовательский инсти. тут морфологии человека АМН СССР (72) В. И. Сороковой, В. А. 111ахламов, A. Г. Марачев и А. В. Корнев (53) 612,015(088.8) (56) De Pierre J. W, Analytical Biochemistrv. 1977. v 83 „ ¹ 4, р. 82. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ

И СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к биологии и медицине, и предназначено для определения фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК). Цель изобретения — ускорение способа за счет одновременной экстракции определяемых веществ и определения их содержания в одном образце. Для этого проводят экстракцию липидов смесью этанол-диэтиловый эфир (1:1) в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют к образцу азотнокислый или сер— нокислый кадмий в концентрации

10 мМ при рН 8,0. Разделение фаз проводят, добавляя воду и диэтиловый эфир так, чтобы конечное соотношение было вода:спирт:эфир — 2:1:2. Верхнюю фазу отбирают, дополнительно экстрагируют водно-спиртовую фазу пентаном в соотношении 2:1:2, верхнюю фазу отбирают и приливают к первому экстракту и смесь экстрактов центрифугируют при 3000-5000

20 мин. Затем верхнюю фазу отбирают, приливают к ней по О,1 об.ч. спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха. Затем формируют тонкую пленку липидов на угольной подложке, регистрируют рентгеновскую флуоресценцию и рассчитывают содержание фосфолипидов и СЖК по интенсивности рентгеновского излучения фосфора и кадмия, используя предварительно построенную теоретическую кривую. 2 табл.

1 13322

Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к липидологии, и может быть использовано для определения фосфолипидов и свободных жирных кислот (СЖК) в биологическом

5 материале.

Цель изобретения — ускорение способа за счет одновременной экстракции определяемых веществ и опрецеления их 1О содержания в одном образце.

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракцию липидов из биологического материала проводят смесью этанол-диэтиловый эфир в соотношении спирт:диэтиловый, эфир 1,0:1,0 (по объему), взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, при добавлении к образцу азотнокислого или 20 сернокислого кадмия в конечной концентрации 10 мМ при рН 8,0. Разделение фаз проводят путем добавления воды и диэтилового эфира в количестве 1,2 и 1,0 объемов соответственно, 25 таким образом, конечное соотношение вода: спирт: эфир равняется 2:1:2. Затем верхняя фаза отбирается.

Вторым этапом является дополнительная экстракция водно-спиртовой ЗО фазы пентаном, взятым в соотношении

2:1:2. Приливают пентан, интенсивно встряхивают смесь в течение 3 мин, дожидаются расслоения, верхнюю фазу отбирают и приливают к первому экстракту. Объединенные экстракты центрифугируют при 3000-5000 g 20 мин при этом происходит удаление воды из экстракта обычно в количестве

0,1-0,2 объема. Затем верхнюю фазу щ отбирают, приливают к ней по 0,1 объемной части спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха.

Третьим этапом является Формирование тонкой пленки липидов на угольной 45 подложке ° Для этого проводят раство— рение экстракта в небольшом количестве диэтилового эфира и наносят его каплями на отполированную угольную подложку. 50

Последний этап включает в себя регистрацию рентгеновской флуоресценции и расчет содержания фосфолипидов и СЖК по интенсивности рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответст- 55 венно с использованием предварительно построенной калибровочной кривой.

Для отработки метода используют рентгеновский энергетический спектро27

2 метр "KEUFX-5100", установленный на базе сканирующего электронного микроскопа "Hitachi S-500". Угольные подложки диаметром 6,5 мм и высотой 23 мм изготавливаются из углеродных стержней, применяемых в электронной микраскопии для напыления, и не имеют собственных пиков характеристического излучения в рабочем диапазоне энергий. Рентгеновскую флуоресценцию регистрируют при условиях. ускоряющее напряжение 20 кВ, расстояние между образцом и детектором — 10 мм, угол наклона образца — 30, площадь регистрации 0,5 х 0,5 мм, ширина канала амплитудного" анализатора 10 эВ на канал, эффективное время регистрации

100 с. Единицей измерения служит величина I отношение числа импульсов характеристического излучения к фоновому в диапазонах 1,91-2,11 для фосфора и 3,03-3,23 для кадмия. Для построения калибровочной кривой исследуют смеси стеариновой кислоты с лецитином или кефалином в соотношении СЖК/ФЛ вЂ” 10, 20, 40 и 100 мол. с экстракцией и последующими манипуляциями описанным способом. Порог количественного определения равняется 5 нмоль, а оптимальный диапазон определения 25-200 нмоль.

Способ может быть употреблен для оценки степени гидролиза фосфолипидов фосфолипазами. Степень гидролиза (мол. ) легко оценивать по соотношению импульсов характеристического излучения кадмия по отношению к фосфору.

Пример. Предлагаемый способ применяют для определения содержания фосфолипидов и СЖК в митохондриях печени белых крыс при активации собственной фосфолипазы. Для этого инкубируют изолированные митохондрии (8,75 мг белка) в изотоническом растворе KCf при рН 8,0 в присутствии

1 мМ CaCt> общим объемом 2,5 мл в течение 60 мин. Через каждые 10 мин производят отбор в количестве 0,2 мл по 3 пробы на определяемую точку.

Далее проводят операции по определению фосфолипидов и СЖК. С.этой целью каждую пробу, содержащую 0,7 мг белка митохондрий вводят в стеклянную пробирку объемом 5 мп с пластмассовой пробкой, где находятся 0,6 мл азотнокислого кадмия в концентрации

13,3 мМ. Затем добавляют 1 мп этилоТ аблица 1

Содержание в пробе

Время инкубации, мин

Фосфолипи- СЖК, нмол ды, нмоль

11,5

230

240 12

5,1

235

8,2

18

220

8,1

8,2

230

-19

8,3

240

12,1

215

12,2

27,5

11,2

245

3 133222 вого спирта и 1 мл диэтиловогo эфира, закрывают пробкой и встряхивают в течение 5-10 мин, Далее добавляют

1,2 мл воды и 1 мл эфира и дожидаются полного расслоения (1-3 мин), после чего отбирают верхнюю фазу в такую же пробирку.

К оставшейся фазе приливают 2 мл пентана, закрывают пробкой и интенсивно встряхивают в течение 3-5 мин, дожидаются расслоения в течение 1

3 мин, затем отбирают верхнюю фазу и приливают к первому экстракту. Центри-, фугируют объединенный экстракт при

3000 g 20 мин. При этом образуется нижняя фаза (водно-спиртовая) в количестве 0,1-0,3 мл. Верхнюю фазу отбирают) и переносят в другую пробирку.

Добавляют по 0,3 мл спирта и толуола и упаривают под вакуумом досуха (20-40 мин), затем к получившемуся экстракту добавляют 0,3 мл эфира для растворения и с помощью микрошприца наносят экстракт на угольные подложки диаметром 6,5 мм, высушивая на вбздухе, и регистрируют рентгеновское излучение с помощью мнкроанализатора 30

"KEVEX-5200". Рассчитывают по калибровочной кривой содержание фосфолипидов и СЖК в пробах. Полученные результаты представлены в табл. 1.

4

Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов приведена в табл. 2.Формула изобретения

Способ определения фосфолипидов и свободных жирных кислот в биологическом материале путем экстрагирования проб; органическими растворителями в присутствии солей двухвалентных металлов, высушивания экстракций для получения тонких пленок с последующим рентгеноспектральным анализом, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, в качестве солей двухвалентных металлов используют азотнокислый или сернокислый кадмий в конечной концентрации

10 мИ при рН 8,0, экстракцию проводят смесью диэтиловый эфир: этиловый. спирт в объемном соотношении 1:1, взятой в количестве 2,5 объема по отношению к пробе, добавляют диэтиловый эфир и воду до достижения соотношения объемов диэтиловый эфир:втиловый спирт . вода 2:1:2, эфирную фазу удаляют, а к водно-спиртовой фазе дополнительно добавляют пентан в объемном соотношении 2:1:2, отбирают верхнюю фазу, а фосфолипиды и свободные жирные кислоты определяют по интенсивности характеристического рентгеновского излучения фосфора и кадмия соответственно.

Степень гид- Средняя ролиза, мол.7 степень гидролиза, мол.Ж

1332227 одержание в пробе ень эа, м осфолипи- СЕК, нмол ды нмоль

13,1

220

12,9

260

14,3

14,2

240!

6,7

210

17,2

220

17,1

17,8

225

16,3

245

Т а б л и ц а 2

Характеристика предлагаемог способа . звес

Экстракция липидов

10-15 смесь спирт — эфир

5-10 реэкстракция пентаном удаление водно-спиртовой фазы

60-120

20 расслоение упаривание

2-3

Приготовление проб

Регистрация характеристического излучения

20-30

10-15

20-25.2-5

Время кубаци мин

15-20

20-40

Продолжение табл. 1

Средняя степень гидролиэа, мол.Х

Экстракция липидов метанол-хлороформ центрифугирование реэкстракция метанолхлороформом

Определение количества фосфолипидов упаривание экстракта обработка хлорной кислотой инкубация с амидолом и молибдатом аммония колориметриров ание

Определение свободных жирных кислот

60-120

10-15

1332227

Продолжение табл. 2 экстракция смесью хлороформ-гептан с Ni 10 удаление фосфолипидов силикагелем

10 измерение радиоактивности И на сцинтилляционном счетчике

Итого

260-380

50-85

Составитель Н. Гуляева

Редактор А. Ворович Техред А. Кравчук Корректор А.Обручар

Тираж 776 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . no.äåëàì изобретений и открытий

113035, Москва, E-35, .Раушская наб., д.4/5

Заказ 3826/40

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4