Способ определения оксидазной активности церулоплазмина

 

Для повышения точности и чувствительности способа к пробе, содержащей церулоплазмин, дЬбавляют раствор о-фенилендиамина. Проводят реакцию при 37 С, затем добавляют ингибирующий агент - 96%-ную серную кислоту до конечной концентрации 0,3 - 0,6М. Через 5 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм и рассчитывают активность церулоплазмина. to 4 00 ;о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (19) (11) (51) 4 G 01 N 33/48 С 12 Q 1/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К д ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3972071/28-14 (22) 01. 11. 85 (46) 30.08.87. Бюл. )Ô 32 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха и Киевское предприятие по производству бактерийных препаратов (72) О.Б. Сиверина, В.В. Басевич, P.В. Басова, И .Н. Гавриш, Ю.В. Волощенко, А.И. Ярополов и И.В. Березин (53) 612.015(088.8) (56) Лабораторное дело, 1981, У 6, с. 334-335. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗНОЙ

АКТИВНОСТИ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА (57) Для повышения точности и чувствительности способа к пробе, содержащей церулоплазмин, дЬбавляют раствор о-фенилендиамина. Проводят реако цию при 37 С, затем добавляют ингибирующий агент — 96K-ную серную кислоту до конечной концентрации 0,3

О, 6М. Через 5 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм и рассчитывают активность церулоплазмина.

1334089 с>

D 99 60

А

60 (мин)

15 (мин) Изобретение относится к биохимиии может быть использовано в биотехнологии для контроля производственных процессов и в медицине для диагностических целей.

Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа эа счет использования в качестве субстрата о-фенилендиамина, а в качестве ингибирующего агента — серной кислоты.

Способ осуществляют следующим образом.

К пробе, содержащей церулоплазмин (ЦП), добавляют раствор о-фенилендиамина, предварительно прогретый до нужной температуры, инкубируют и останавливают реакцию добавлением 96%ной серной кислоты до конечной концентрации 0,3-0, 6 М. Через 5 мин.измеряют оптическую плотность при

492 нм и рассчитывают активность ЦП.

Пример 1. Определение актив— ности ЦП в растворе при контроле технологического процесса его очистки (при 37 С) .

В 5 пробирок вносят по 3 мл 2». г

«10 M (210 мг/100 мл буфера) раствора о-фенилендиамина в O,i M буферном растворе ацетата натрия (pH 5,)).

Растворы прогревают в течение 10 мин на водяной бане при 37 С, затем в каждую из пробирок вносят по 0,05 мл исследуемого образца и проводят реакцию в течение 15 мин при 37 С. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл

96%-ной серной кислоты (конечная концентрация 0,3 M) и через 5 мин измеряют оптическую плотность смеси на длине волны 492 нм (099 ); В контрольную пробирку вместо раствора, содержащего фермент, добавляют 0,05 мл буферного раствора.

Так как активность (A) ЦП принято выражать в единицах изменения оптической плотности эа 1 ч, то зная 1 и время проведения определения (в данном случае 15 мин), ее рассчитывают по формуле

D 9 = О, 73 + 0,04 (среднее из 5 измерений) .А=2,94 + 0,15 опт.ед./ч.

При использовании калибровочных графиков можно определить концентрацию ЦП в пробе.. Для рассчитанной активности она равна 0,365

:+0,018 мг/мл., Пример 2. Определение активности ЦП в сыворотке крови с пони— о женным его содержанием (при 60 С) ..

В 5 пробирок вносят по 3 мл

2 10 М (210 мг/100 мл буфера) раствора о-фенилендиамина в 0,1 M буферном растворе ацетата натрия (рН 5,5).

Растворы прогревают в течение 10 мин на водяной бане при 60 С, затем вносят по 0,05 мл исследуемого образца и проводят реакцию в течение 10 мин о при 60 С: Реакцию останавливают добавлением 0,1 мл 96%-ной серной кислоты (конечная концентрация 0,6 М) и через 10 мин измеряют оптическую плотность смеси на длине волны 492 нм.

В контрольную пробирку вместо раствора, содержащего фермент, добавляют

О, 1 мл буферного раствора. Активность

ЦП определяют согласно формуле (1):

D = 0,27+0,02 (среднее из 5 измерений), А=1, 64+0, 1 3 опт. ед. /ч.

Аналогично примеру 1 можно определить концентрацию ЦП в пробе—

0,057 + 0,005 мг/мл.

Для построения калибровочных графиков используются растворы ЦП с известной концентрацией, которую определяют, измеряя П,,д и принимая коэффициент экстинкции равным 1,09 «

«10 M см

Пример 3. Способ осуществляют согласна примеру 1, однако реакцию

1зстанавливают 83 мкл серной кислоты, конечная концентрация 0,5 M. D

99Ь

=0,480+0,071, оксидазная активность соответственно равна 1,92 +

+0,28 отн.ед/ч. При использовании калибровочного графика, при построе-. нии которого реакцию также останавливали добавлением 83 мкл 96%-ной

Н 504 к реакционной смеси, можно определить концентрацию ЦП в пробе.

Данные по определению активности

ЦП в сыворотке крови представлены в таблице.

Формула изобретения

Способ. определения оксидазной активности церулоплаэмина путем инкуба1334089

Концентрация ЦП в сыворотке здоровых людей, определенная с по" мощью предлагаемого способа, Ч

Относительная опйибка, Х

Концентрация ЦП, мг/100 мл

15,59+0,70

5,0

19, 48+0, 84

4,3

2,9

3,4

2,3

Составитель Н. Гуляева

Редактор А. Огар Техред И.Попович Корректор Л. Пилипенко

Заказ 3959/43 Тираж 776

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ции образца, содержащего церулоплазмин, с субстратом в присутствии буфера с поеледующей остановкой реакции ингибирующим агентом и спектрофотометрированием, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повьппения точ17,30+0,50 l5,70+0,61

17,69+0,41 ности и чуствительности способа, в качестве субстрата используют о-чфенилендиамин, а в качестве

5 ингибирующего агента серную кис— лоту в конечной концентрации О, 3— 0,6 М.