Способ определения фосфолипидов в биологическом объекте
Изобретение относится к медицине , предназначено для определения фосЛолипидов в лабораторной практике . Цель изобретения - ускорение способа . К пробе белка субклеточных фракций печени крысы прибавляют пробу смеси метанол-хлороформ (1:1) и упаривают досуха при 40°С.К сухому остатку прибавляют пробу толуола и параллельно такое же количество добавляют в пробирку (холостой опыт) и нагревают 30 с при 30-50 С, затем добавляют раствор ферротиоцианата аммония и 1 мин размешивают на миксере . После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 им на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром против холостой пробы. Для осветления мутного толуолового слоя добавляют несколько кристаллов безводного сульфата натрия. 2 табл. (Л со со 4 О СХ) со
СОКИ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ . РЕСПУБЛИН (1Ю (11) (51} 4 6 01 N 33 48
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
H А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3894250/28-14 (22) 07.03.85 (46) 30.08,87. Бюл. В 32 (71) Винницкий медицинский институт им. Н.И.Пирогова (72) А.А.Пентюх, В.И.Гуцол, А.К.Откаленко, О,А.Яковлева и Ю.В.Однорогов (53) 612.015(088.8)
I (56) Analytical biochemistry, 1980, ч. 104, р. 10-14. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОСФОЛИПИДОВ
В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБЪЕКТЕ (57) Изобретение относится к медицине, предназначено для определения фосфолипидов в лабораторной практике. Цель изобретения — ускорение способа. К пробе белка субклеточных
-фракций печени крысы прибавляют пробу смеси метанол-хлороформ (1: 1) и о упаривают досуха при 40 С.К сухому остатку прибавляют пробу толуола и параллельно такое же количество добавляют в пробирку (холостой опыт) и нагревают 30 с при 30-50 С, затем добавляют раствор ферротиоцианата аммония и 1 мин размешивают на миксере. После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром против холостой пробы. Для осветления мутного толуолового слоя добавляют не- 3 сколько кристаллов безводного сульфата натрия. 2 табл.
340
25
13
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для опре деления фосфолипидов в лабораторной практике, Цель изобретения — ускорение способа путем совмещения процессов экстракции фосфолипидов и высушива— кия экстракта, Пример 1. К 0,25 мг белка субклеточных фракций печени крысы прибавляют 1,5 мг смеси метанол-хлороформ в соотношении 1:1 и упаривао ют досуха при 40 С (слецы метанола завышают результаты определения фосфолипидов), К сухому остатку прибавляют 3 мл толуола (параллельно в пробирку на-. ливают 3 мл толуола — холостой опыт и нагревают 30 с при 50 С, затем прибавляют 2 мл раствора ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и 30,4 тиоцианата аммония растворяют в 1 л воды) и встряхивают в течение 1 мин или раз,.мешивают на миксере.
После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром, против холостой пробы. Кювета не должна содержать воду. Если толуоловый слой мутный, то кювету можно нагреть в теплой воде или добавить несколько кристалликов безводного сульфата натрия, !
Пример 2„. К 1 мг белка суб-. клеточных фаркций печени крысы прибавляют 1,.5 мл смеси метанол.-хлороформ в соотношении 1: 1 и упаривают о досуха при 70 С (следы метанола завышают результаты определения фосфолипидов), К сухому остатку прибавляют 3 мл толуола (параллельно в пробирку на-ливают 3 мл тол ола — холостой опыт) и нагревают 60 с при 60 С, затем прибавляют 2 мп раствора ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и
30,4 тиоцианата аммония растворяют в 1 л воды) и встряхивают в течение
1 мин или размешивают на миксере.
После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу и фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром против хо83 2 лостой проб:„ K e He o H содержать воду. Если голуоловый слой мутный, то кювету можно нагреть в
-. åïëîé воде или добавить несколько кристалликов безводного сульфата натрия.
П р и м e g 3. K 0.1 мл сыворотки крови прибавляют 1,5 мл смеси метанол-хороформ в соотношении 1: 1 о и упаривают досуха при 70 С (следы метанола завышают результаты определения фосфолипидов).
К сухому остатку- прибавляют 3 мл толуола (параллельно в пробирку наливают 3 мл толуола — холостой опыт) и нагревают 60 с при 60 С, затем прибавляют 2 мл раствора ферротиоцианата аммония (27,03 г гексагидрата хлорного железа и 30,4 грамма тиоцианата аммония растворяют в
1 л воды) и встряхивают в течение
1 мин или размешивают на миксере.
После расслоения фаз из верхней толуоловой фазы отбирают пробу в кювету и фотометрируют при 448 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с соответствующим фильтром
\ против холостой пробы. Кювета не должна содержать воду. Если толуоловый слой мутный, то кювету можно негреть в теплой воде или добавить несколько кристалликов безводного сульфата натрия.
Пример 4. Б табл.1 и 2 приведены данные по сравнению метоца Стеварта (1>) с предлагаемым способом (А).
При сравнении специфичности пред4 ц0 .лагаемого способа и способа-прототипа каких-либо различий не выявлеНО.
Предлагаемый способ количественного определения фосфолипидов по
l8 сравнению с известныйи сокращает время анализ- с 48 до 1-2 ч, упрощает методику„ исключая из нее процесс отмыьки и дозированный отбор проб. а также уменьшает количество
5G фосфолипида, необходимое для минимальных определений.
Ф о р и у л а и з о о р е т е н я
Способ определения фосфолипидов в биологическом объекте., включающий экстракцию фосфолипидов смесью хлороформ-метанол. паривание экстракта с послецунп ей реэк стракцией
Аосфолипидов, обработкой полученз
1334083 ного продукта раствором ферротиоци- си досуха при температуре от 40 С аната аммония и фотометрированием, до температуры закипания экстрагиотличающийся тем, что, рующей смеси, а реэкстракцию проводят с целью ускорения способа, экстракцию, при нагревании в течение 30-60 с
5 о проводят в процессе упаривания сме- и температуре 50-60 С.
Таблица 1
Микросомы печени крыс, мкг/мг белка
Показа- тель
Сыворотка крови человека, мг/л без добавки фосфатидилхолина без добавки фосфатидилхолина
A В
А Б
А Б
А Б
2000 3113 2913
120 108 209
266 381 358
2135
284
9,1
14,0
4,7
69 3,1
7,2 3,2
40 36
5,3
3,8
5,9 3,5
7 открытия добавки
97,8 91,3
97,0 92,0
Таблица 2
Вещество (100 мкг) Оптическая плотность
А в
Фосфатидилхолин 0,270 0,270
Триолеин 0 0
СРавнение предлагаемого. способа определения фосфолипидов (A) с . методом Стеварта (Б), n = 10
1 с добавкой фосфатидил холина (100 мкг/1 мл) Специфичность определения фосфолипидов при сравнении предлагаемого способа (А) с методом Стеварта (Б) (максимум пропускания
490+10, длина светового пути 10 мм) с. добвкой фосфатидилхолина (100 мкг/1 мл) 13,1 21,5
4,4 7,2
3,4 7,2
1334083
Продолжение табл. 2
Оптическая
Вещество
100 мкг плотность
А В
Метилолеат
Метилстеарат
Олеат
Линолеат
О
О
Стеарат
Холестерин
0,012
0,004
Холат
0,012
0,004
Дезоксихолат
Гликодезоксихолат натрия
0,012 0,012
Таурохолат натрия
0,024
0 050
О, 024
0,050 Тритон Х-100
Аминокислоты (глицин., цистеин> серин метионин валин, норвалин, лейцин, норлейцин, алании, аспарагиновая кислота, . аспарагин, глутаминовая кислота, лизин, аргинин, фенилаланин, тирозин, триптофан, гистидин, пролин, орнитин) (О
Составитель А.Агуреев
Редактор А.Огар Техред JI.Ceðäêæoâà Еорректор В.Бутяга
Заказ 3958/42 Тираж 776 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ys..Ïðîåêòíàÿ,4
