Способ получения ингибиторов протеиназ серой гнили подсолнечника

 

Изобретение относится к биотехнологическим методам исследований биологически активньхх соединений и может быть использовано при оценке биологической активности ингибиторов микробных протеиназ из семян растений . С целью повьппения выхода и ак тивности ингибиторов протеиназ серой гнили подсолнечника и упрощения процесса определения анализируемые образцы семян (10-12 шт.) замачивают в воде в течение времени от 30 до 60 мин при температуре от 10 до 20®С,. а полученный раствор ингибитора лиофилизируют. Препарат ингибитора вносят в лунки на агаровой пластинке, зараженной спорами патогена. О биологической активности ингибиторов судят по размерам грибницы патогена и количеству заросших лунок. Предложенный способ позволяет упростить процесс определения биологической активности ингибитора протеинез серой гнили подсолнечника и повысить удельную активность и выход ингибиторов более чем в 1000 раз по сравнению с известным способом. 4 табл. f, С

Stall I

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЯИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (511 4 С 12 И 9/50 // (С 12 N 9/50, С 1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К А BTOPCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ / rr Ц

49g:1 .- - .. (21) 4128570/30-13 (22) 18.07.86 (46) 07 ° 04.88. Бюл. М 13 (71) Всесоюзный селекционно-генетический институт (72) В.М.Балаян, А.П.Левицкий и В.Б.Погорлецкая (53) 577.15(088.8) (56) Agren G., Leiden S A. Some

chemical and biological properties

of à protein concentrate from sunflower seeds. - Acta chemica Scandinavica, 1968, 22, р. 1981-1983.

Halim А.Н., Wassom С.Е., Mitchell .Н.G. Suppression of fungal

growth by isolated. trypsin inhibitors of corn grain. - Е. Agr. and.

Food Chem., 1973, 21, 6, р. 1118Ill9 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ

ПРОТЕИНАЗ СЕРОЙ ГНИЛИ ПОДСОЛНЕЧНИКА (57) Изобретение относится к биотехнологическим методам исследований биологически активнйх соединений н,. SU „„)АРМЯН А1 может быть использовано при оценке биологической активности ингибиторов микробньгх протеиназ из семян растений. С целью повышения выхода и активности ингибиторов протеиназ серой гнили подсолнечника и упрощения процесса определения анализируемые образцы семян (10-12 шт.) замачивают в воде в течение времени от 30 до

60 мин при температуре от IO до 200С,, а полученный раствор ингибитора лиофилизируют. Препарат ингибитора вносят в лунки на агаровой пластинке, зараженной спорами патогена. О биологической активности ингибиторов судят по размерам грибницы патогена и количеству заросших лунок. Предложенный способ позволяет упростить процесс определения биологической активности ингибитора протеинез серой гнили подсолнечника и повысить удельную активность и выход ингибиторов более чем в 1000 раз по сравнению с .известным способом; 4 табл.

1386659

Изобретение относится к биотехологическим методам исследований иологически активных соединений и ожет быть использовано при оценке биологической активности ингибиторов микробных протеиназ из семян растений.

Цель изобретения — повышение выхо. да и активности ингибиторов протеи наз и упрощение процесса их раэделе ния.

Анализируемые образцы семян (1012 шт.) подсолнечника помещают в стеклянные стаканчики и эамачивают их в 5 мл воды. При изучении влияния различного времени замачивания на выход ингибиторов из семян отмечено, что максимальной ингибиторной актив1 ностью обладает раствор после 3,5 ч, замачивания. Однако для выделения ин( гибиторов целесообразно использовать

l замачивание образцов в течение 30 60 мин, так как при более длительном периоде, кроме исследуемых ингибито ров, начинают диффундировать в раствор и более высокомолекулярные соединения; в частности протеолитические ферменты. При более коротком времени эамачивания количество ингибиторов протеинаэ оказывается меньшим (табл. 1).

Учитывая, что на скорость диффузии ингибиторов через оболочку семян может влиять температура окружающего семена раствора, исследовали влияние различных температур на этот процесс, Изучали интервал температуры 5-40 С при эамачивании семян B течение

60 мин. В растворе определяли ингибиторную и протеолитическую активность, а также содержание белка (табл. 2) °

Как видно из представленных в табл. 2 данных, оптимальной температурой для выделения ингибиторов являет- 45 ся 10-20 С, При более низкой температуре ингибиторная активность в раст. воре значительно ниже. Увеличение температуры раствора приводит к диффузии в раствор других белков, не об- 50 ладающих ингибиторной активностью.

Полученный при замачивании в течение 60 мин при 20 С препарат ингибитора протеиназ серой гнили использовали для определения биологической 55 активности, Определенная энзимологическими методами удельная активность полученного предлагаемым способом препарата ингибитора протеинаэ в 80100 раз выше, чем выделяемого по известному способу, Для определения биологической активности готовили питательную среду, состоящую из казенка (источник азота), минеральных веществ, агар-агара и глюкозы (источник углеводов), которую помещали в чашки

Петри, стерилизовали и в застывшей среде делали по окружности 6 лунок диаметром 10-12 мм и высотой 3-4 мм на одинаковом расстоянии одна от другой. Затем в эти лунки вносили раствор ингибитора протеиназ (пипеткой

0,4-0,5 мл) и заражали среду спорами патогена. В течение 14-15 сут наблюдали рост культуры серой гнили. О биологической активности ингибиторов судили по размерам грибницы патогена и количеству заросших лунок.

Пример l. Используют семена подсолнечника, которые замачивают указанным способом, а полученный раствор ингибитора и ингибитор, полученный по известному способу, сравнивают по антиферментному действию и биологической активности, помещая раствор (1 мг препарата в 1 мп) в лунки на питательной среде (табл. 3). Ингибиторную активность определяют по гидролизу казеина, а удельную активность рассчитывают на единицу белка в исследуемом растворе. Высокая удельная ингибиторная активность объясняется отсутствием в экстрактах балластных белков.

По антиферментной активности препарат ингибитора, полученный предлагаемым способом, превосходит известный более чем в 1000 раз и значительно выше по действию на культуру патогена.

Пример 2. В табл. 4 показано сопоставление предлагаемого способа и известного.

Преимущество предлагаемого способа заключается в упрощении процесса разделения и определении биологической активности ингибиторов, а также в увеличении активности раствора ингибиторов по сравнению с известным способом.

Формула из о брет ения

Способ получения ингибиторов протеинаэ серой гнили подсолнечника, включающий обработку семян подсолнечника с получением раствора ингибито1386659 что, с целью повышения выхода и активности ингибиторов протеиназ и упрощения процесса их разделения, раст5 вор ингибиторов получают обработкой семян подсолнечника замачиванием в воде при температуре от 10 до 20 С в течение времени от 30 до 60 мин.

Таблица 1

Ингибиторная активность ед./л, по

Время эамачивания протеиназам серой гнили трипсину

15 мин 30 мин

0,021

0,043

0,061

1 ч

2,74

0,084

2 ч

42,41

21,72

27,61

3,5 ч

0,118

0,190

0,282

0,021

0,02

7 ч

12 ч

0,,03

HCPooS

0,01

5,22

Таблица 2

Ингибиторная активность, ед./л, по

Температур раствора, ОС

Активность протеинаэ, нкат/л

Содержание белка,г/л протеина- трипсину зам серой гнили

0,043

0,090

0,096

0,085

О 087

0,009

30

НСРО,05 ра и его лиофилизацию с последующим определением биологической активности по интенсивности роста патогена вокруг лунок с внесенным ингибитором на агаризованной среде, содержащей казеин, глюкозу, микроэлементы и воду, отличающийся тем, 0,051

0,122

0,130

0,141

0,156

О ° 142

0,134

0,012

Активность Содержание протеиназ, белка,г/л нхат/л

0,046

0,125

0,134

0,212

0,325

0,015

1386659

Т а б л и ц а 3

Ингибиторная активКоличество

Исследуемый препарат заросших лунок на чашках Петри, шт. ность, ед./кг бел ка

По предлагаемому способу

2,1 10

По известному способу

1,75

Таблица 4

Известный способ Отличительные признаки

Предлагаемый способ

1. Замачивание семян 1. Размол семян

В предлагаемом способ исключаются операции

1-7

2. Лиофилизация раст-2. Обеэжиривание вора ингибитора (сушка) Це "т.,:: фугирование

Высаливание

Центрифугирование

7. Диализ

Составитель Л.Борисова

Редактор В.Петраш Техред М.Ходанич Корректор В. Гирняк

Заказ 1471/31 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из 1 r семян полу-4. чают 0 5 мг ингибитора с удельной активностью 2,1 " 5, «10 ед./кг белка.

Общий выход 1,05" 6. .«10 3 ед

Лиофилизация

Иэ I г семян получают 10 мг ингибитора с удельной активностью 1,75 ед./кг белка.

Общий выход

1,75 10 ед.