Консорциум штаммов бактерий lеuсоnоsтос oenos ,используемый для кислотопонижения виноградного сусла и виноматериалов
Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциативной культуры, состоящей из штаммов молочнокислых бактерий вида Leuconostoc olnos, которая может быть использована в винодельческой прО1« 1шпенности. Целью изобретения является получение нового консорциума штаммов бактерий Leuconostoc olnos ВКШ В-3365 (Таировская 1), обладающего более высокой активностью биологического кислотопонижения в сусле и виноматериале разных сортов и различного состава и способного, в свою очередь, утилизировать яблочную кислоту при низком значении рН, высоком содержании винной кислоть1, сернистого ангидрида и при низких температурах. Новый консорциум содержит следующие штаммы бактерий: Т-А12, Т-118, Т-120, Т-2С и Т-96 в соотношении 20:20:20: :20:20%. Данные штаммы получены в результате селекции производственных микроорганизмов и выделены из сухих бельк виноматериалов сорта Алиготе и Ркацители,, Консорциум способен проводить процесс яблочно-молочного брожения в виноматериале сорта Алиготе при содержании титруемых кислот 13,3 г/л, винной кислоты 7,8 г/л, сернистого ангидрида 10,0 мг/л свободного и 70,0 мг/л общего , при рН 2,75 в течение 14 сут. Содержание титруем 1х кислот в процессе биологического кислотопонижения снижается с 11,6 до 6,3 г/л. Ниноматериалы, в которых прошло яблочно-молочное брожение, при задаче консорциума молочно-кислых бактерий Таировская-1 имеют вьфаженный сортовой аромат, мягкие по вкусу и получили дегустационную оценку 8,1-8,3 балла. 8 табл. I (Л со 00 О) О) 01 О5
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
„„SU„„1386656 А 1 (51) 4 С 12 N 1/20, С 12 P 39/00
С 12 С 1/02//(С 12 N 1/20, С 12 R 1 .01) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4025323/30-13 (22) 16 ° 12.85 (46) 07.04,88. Бюп, 11 13 (71) Научно-производственное объединение по виноградарству и виноделию (72) Л.ВКолегова, Г.И.Размадзе и Л,А.Иатвийцук (53) 663,257.9 (088,8) .(56) Авторское свидетельство СССР
9 1125235, кл. С 12 С 1/02, )982. (54) КОНСОРЦИУМ HITAMMOB БАКТЕРИЙ
LEUCONOSTOC OLNOS, ИСПОЛЬЗУЕММЙ ДЛЯ
КИСЛОТОПОНИЖЕНИЯ ВИНОГРАДНОГО СУСЛА
И HHHOMATEPHAJIOB утилизировать яблочную кислоту при низком значении рН, высоком содержании винной кислоты, сернистого ангидрида и при низких температурах.
Новый консорциум содержит следующие штамиы бактерий: Т А12 Т-118, Т-120, Т-2С и Т-96 в соотношении 20:20:20:
:20:20Х. Данные штаммы получены в результате селекции производственных микроорганизмов и выделены из сухих белых виноматериалов сорта
Апиготе и Ркацители.. Консорциум способен проводить процесс яблочно-молочного брожения в виноматериапе сорта Апиготе при содержании титруемых кислот 13 3 r/ë, винной кислоты
7,8 г/л, сернистого ангидрида
10,0 мг/л свободного и 70,0 мг/л общего, при рН 2,75 в течение 14 сут, Содержание титруемых кислот в про- С цессе биологического кислотопонижения снижается с 11,6 до 6,3 r/ë, Ви- Я номатериалы, в которых прошло яблочно-молочное брожение, при задаче консорциума молочно-кислых бактерий
Таировская-l имеют выраженный сортовой аромат, мягкие по вкусу ы полу- 4 чили дегустационную оценку 8,1-8,3 балла, 8 табл, С (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциативной культуры, состоящей из штаммов молочнокислых бактерий вида Leuconostoc
olnos которая может быть использована в винодельческой проишытенности. Целью изобретения является полу« чение нового консорциума штаммов бактерий Leuconostoc o3nos ВКПИ В-3365 (Таировская 1), обладающего более высокой активностью биологического кислотопонижения в сусле и виноматериале разных сортов и различного состава и способного, в свою очередь, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н АBTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ,/ " 13
Щдц;;,, 1386656
Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциативной культуры, состоящей из штаммов молочнокислых бактерий вида Leuconostoc 5
olnos, которая может быть использована в винодельческой промышленности б
Цель изобретения — получение нового консорциума молочнокислых бак- 1О терий вида Leuconostoc olnos, обладающего более высокой активностью биологического кислотопонижения в сусле и виноматериале разных сортов и различного состава и способного утилизйровать яблочную кислоту при низком значении рН, высоком содержании винной кислоты, сернистого ангидрида и при низких температурах.
Консорциум бактерий Leuconostoc 20
1 о1поз ВКПМ B-3365 (Таировская- l ) содержит следующие штаммы молочнокислых бактерий: Т-А„, Т-118," Т-120, Т-2С и Т-96 в соотношении,20: 20: 20:
: 20: 20 . 2S
Штаммы, входящие в консорциум, выделены из белых сортов виноматериалов: Т-А„, Т-2С и Т-96 — иэ виноматерйала сорта Апиготе 22 января
1982 г,, Т-120 и Т-118 — иэ винома- 30 териала сорта Ркацители 30 ноября
1983 г.
Выделение бактерий проводили по следующей схеме: высев l исследуемого виноматериа- 35 ла в среду МРС+вино (1:1) + леворин +
+ слой вазелинового масла в 1 см; пересев через 48 ч на твердую питательную среду МРС, инкубация при =28 С; 40 выделение молочнокнспых бактерий иэ о тдельных колоний е
Штаммы характеризуются следующими морфолого-культурапьными и фиэиологобиохимиче скими признаками. 45
Морфолого-культуральные признаки.
Все штаммы, входящие в консорциум (Т-А,, Т-118, Т-120, Т-2С и Т-96),— грамположительные неподвижные кокки размером 0,7-1 0 мкм, факультативные . >О анаэробы. На агариэованной среде МРС при t=28 С на вторые сутки дают слабый рост в виде белых гладких полупрозрачных колоний диаметром О, l1 мм, В жидкой среде МРС + вино (1:1)
>5 образуют беловатую муть с выраженным осадком, который при вэбалтывании поднимается вверх в виде шелковистых волн. Не образуют слизи.
Физиолого-биохимические признаки.
Штамм Т-А 1 нри разложении глюкозы образует гаэ, не образует аммиак нз аргинина. Сбраживает глюкозу, арабиноэу, мальтозу, сахарозу, целлобнозу, не сбраживаег ксилозу, лактоэу, меллибиозу, рафинозу, маннит, сорбит, глицерин. Не восстанавливает нитраты и нитриты, не разжижает желатин, Не усваивает цитрат, усваивает малат, не разлагает тартрат. Каталаэоотрицательный, Штамм Т-118 при разложении глюкозы образует газ, не образует аммиак иэ аргинина.
Сбраживает арабиноэу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, меллибиоэу, сорбит; не сбраживает лактозу, галактозу, рафиноэу, мапьтозу, целлобиозу, Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин. Не усваивает цитрат и тартрат. Усваивает малат.
Каталазоотрицательный, Штамм Т-2С образует при разложении глюкозы газ, не образует аммиак иэ аргинина. Сбраживает глюкозу, арабиноэу, маннозу, мапьтозу, целлобиоэу, не сбраживает галактозу, лактозу, рафинозу, caxaposy, маннит, сорбит. Не восстанавливает нитраты в ннтрнты, не разжижает желатин, не разлагает глицерин. Не усваивает цитрат и тартрат, разлагает малат, Каталоэоотрицательный.
Штамм Т-120 при разложении глюкозы образует газ, не образует аммиак иэ аргинина, Сбраживает глюкозу, арабиноэу, кснлозу, маннозу, галактоэу, целлобиозу, не сбраживает лактозу, рафинозу, маннит, сорбит, Не восстанавливает нитраты s нитриты, не разжижает желатин, не разлагает глицерин, Не усваивает цитрат и тартрат. Усваивает малат. Каталазоотрицательный, Штамм Т-96 при разложении глюкозы образует ras. Не образует аммиак из аргинина, Сбраживает глюкозу, арабиноэу, ксилозу, мальтозу, caxaposy, не сбраживает галактозу, маннозу, целлобиозу, рафинозу, маннит. Не восстанавливает нитраты в нитриты, не разжижает желатин, не разлагает глицерин. Не усваивает цитрат и тартрат, разлагает мапат. Катапазоотрицательный.
Некоторые штампы молочнокислых бактерий могут накапливать в винах нежелательный биогенный амин - гис56
Способность бактерий утилизировать яблочную кислоту при различном содержании титруемых кислот, винной кислоты и рН определяли на виноматериале сорта Апиготе в пяти вариантах при содержании сернистого ангидрида свободного 8, 10 и 11 мг/л, общего
60, 70 и 75 мг/л (табл.1).
Разводку молочнокислых бактерий вносили в количестве 5Х в виноматериал, разлитый в колбы по 50 мп, Киспотопонижающую способность молочнокислых бактерий проверяли по следующим показателям: содержание титруемых кислот, рН, качественное определение яблочной и молочной кислот методом бумажной хроматографии.
Утилизацию яблочной кислоты бактериями констатировали снижением титруемой кислотности, исчезновением яблочной кислоты, повьппением рН, учитывали также скорость яблочно-молочного брожения (ЯМБ), Свойства наиболее активных штаммов указаны в табл,2 °
Из данных табл.2 видно, что штам- мы Т-118, Т-120, Т-96, Т-А, способны утилизировать яблочную. кислоту в виноматериале при рН 2,8. Штаммом
Т-А„ и Т-2С утилизируют яблочную, кислоту при содержании свободного сернистого ангидрида 11,0 мг/л, После получения консорциума из данных штаммов повторно проверяли кислотопонижающую способность каждого штамма, входящего в ассоциацию, и ассоциативной культуры (табл.3).
Проверку проводили на виноматериале .сорта Апиготе, Как видно из табл.3, ассоциативная культура способна утилизировать яблочную кислоту в виноматериале с титруемой кислотностью
13,3 г/л, содержанием винной кислоты
7,8 г/л, сернистого ангидрида свободного 11 мг/л и общего 75 мг/л, рН
2,80 в течение 14 сут, активные штамма Т-А,, и T-120 за 30 сут. Штаммы
Т-2С, Т-96 и Т-118 только частично проводят яблочно-молочное брожение в экстремальных условиях.
Кислотопонижающую способность консорциума проверяли в высококислотном виноматериале сорта Апиготе с разлиными сочетаниями яблочной и винной кислот (табл.4}.
20
2 r
0,2 г
3 13866 тамии, который значительно ухудшает вкусовые качества этих вин, Все штаммы молочнокислых бактерий, входящие в состав ассоциативной культуры Таировская-1 не образуют . гистамин иэ гистидина.
Консорциум штаммов сохраняют в жидкой среде, состоящей из МРС и ви.номатериала 1 1 при t 4-10 С с пере- 10 севом один раз в 3 мес. При этом культура сохраняет высокую биохимическую активность, Состав среды МРС:
Пептон 10 r
Дрожжевой автолизат 50 мп
Иясная вода 100 мп
Твин-80 1 мл
Глюкоза 20 r уксу снокислый натрий 5 r
Лимоннокислый аммоний трехзамещенный (C Фосфорнокйслый калий двузамещенный (K HP0 g 3Н 0) Сер но кислый 30 магний (м8804 7Н О) Сернокислый марга+ нец (SO+ 4Н О) - . 0,05 r 35 Дистиллированная вода До1л Консорциум штаммов ВКПХ -3365 получен при совместном культйвировании на среде МРС + вино (1:1) молоч- 40 нокислых бактерий — штаммы Т-А, Т-120, Т-118, Т-2С к Т-96, Питательную среду инокулировали указанными штаммамн одновременно в равных соотношениях (1: 1 1: 1:1), Бактерии выра- 45 щивали при С=28 С в течение 30 сут при еженедельном пересеве, Отбор лучших штаммов из 120 выделенных культур молочнокислых бак- 50 терий в сравнении с производственными аналогами проводили с учетом требований, предъявляемых к микроорганизмам, используемым для проведения кислотопонижения виноградного сусла и столовых виноматериалов, Щтамию должны обладать высокой кислотоустойчивостью, сульфитостойкостью, холодостойкостью, Данные табл.4 свидетельствуют о том, что если титруемая кислотность 1386656 6,представлена в основном винной кис лотой, то ассоциативная культура спо;собна утилизировать яблочную кислоту в виноматериале при содержании тит5 руемых кислот 13 г/л (количество винной кислоты 7,4 г/л). При содержа нии в виноматериале больших количеств яблочной кислоты (количество винной кислоты 3,4 г/л) культура проводит процесс яблочно-молочного брожения при титруемой кислотности 15 г/л. Консорциум и входящие в его состав штаммы проверяли на кислотопониающую способность при 10, 18 и 25 С,!» сследование проводили на стерильом виноматериале сорта Ркацители следующего химического состава; со.— ержание титруемых кислот 10,8 г/л, инной кислоты 6,0 r/ë, рН 3,2 со- 20 ержание сернистого ангидрида свободного 10 мг/л и общего 60 мг/л (табл.5). Данные табл,6 свидетельствуют о том, что культура способна проводить Процесс яблочно-молочного брожения виноматериале с высокой исходной титруемой кислотностью (13,2 г/л) и высоким содержанием винной кислоты (7,0 г/л). Титруемая кислотность .при этом снизилась с 13,2 до 7,8 г/л три небольшом накоплении летучих | Как видно из табл.5, полученный 25 консорциум штаммов утилизирует ябочную кислоту при t = 25 С в течеие 5 сут, при t = 18 С.в течение 12 сут, при !О С в течение gl сут. Штаммы Т-Aqt, Т-96 и Т-2С 30 проводят процесс яблочно-молочного брожения эа 7 сут, при t 18 С за 14 сут, при = 10 С в течение сут. Штаммы Т.-120 и Т-118 кис отопонижение проводят при 25 С течение 10 сут, при t = 18 С за 1 сут, при t = !О С в течение )5 сут. В табл,6 представлена сравнительная характеристика белого столового 40 Вина сорта Алиготе, приготовленного 9 полупроизводственных условиях с биологическим кислотопонижением с помощью культуры Таировская-1. Раз" одку бактерий готовили в лаборатор- 45 алых условиях на виноградном сусле, разбавленном водой в соотношении ,1:1, и вносили в емкость с виноматериалом V 160 л. кислот (на 0,1 г/л больше контролъного варианта ). В опытном виноматериале хорошо идут восстановительные проце ссы. Окислительно-восстановительный потенциал снизился с 409-до 364 мВ против 384 мВ в контрольном образце, уменьшилось количество альдегидов, увеличилось содержание редуктонов. Содержание азотистых веществ ниже также в опытном виноматериале, где яблочно-молочное. брожение прошло полностью, Следовательно, этот виноматериап является более стабильным, менее склонен к помутнениям и переокисленности. Этот образец виномате« риала был мягким, гармоничным, полным во вкусе, имел ярко выраженный сортовой аромат и получил высокую дегустационную оценку 8,3 балла, Контрольный образец виноматериала получил оценку 7,9 баллов за счет грубой зеленой кислотности, негармоничности во вкусе, Сравнительная характеристика консорциумов штаммов Таировская-1 и K-48Ф представлена в табл ° 7, Пример 1 ° Консорциум штаммов выращивают в виноградном сусле сорта Каберне, разбавленном 1: l Н О, Полученную 2-суточную разводку бактерий в количестве 3-5Х задают в емкость V 160 дал. Виноматериал имеет следующие кондиции: содержание титруемых кислот 10 г/л, винной кислоты 4 г/л, pH = 3,1, содержание сернистого ангидрида свободного 15 мгlл и общего 75 мг/л, По истечении 5 сут кислотность исследуемого виноматериала снижается до 5,6 г/л, рН повьппается до 3,5, по данным хроматографических исследований полное исчезновение яблочной кислоты, Вино после кислотопонижения является мягким, гармоничным во вкусе и имеет дегустационную оценку 8,2 балла по сравнению с контрольным образцом, который имеет оценку 7,9 балла. Пример 2, Бактериальную разводку культуры накапливают в культиваторах, заполненных на 2/3 объема пастеризованным суслом, задают 5— 1О разводки, Культивирование молочнокислых бактерий проводят при постоянной температуре 25 С и периодическом перемешивании для равн<;мерного распределения бактериальной массы. 1386656 Таблица l Винная кисло» Вариант Титруемая рН та, г/л кислотНОСТЬ, г/л 4,5 8,6 3,2 10,4 5,4 3 05 ll 4 6,1 2,95 7,0 2,85 12,5 7,8 2,80 13,3 Таблица2 8,0/60,0 11,0/75,0 8)0/60)0 11,0/75,0 l0 3 2 8 3 ° ++ 7 8! 3,3 6,6 3,2 3,33 . ++! » 7 ! 30 8,6 Т 2С 4,5 8,6 бб 32 333 ++ 6)6 3,2 3 33 ++ 8,6 4,5 7,8 t3,3 Т 118 Т 120 8,0/60,0 10)4 2,8 З,t ++ 8,0/60 0 8,0/60,0 104 28 3 ° t ++ 7 8 ° 13 3 S4 10 ° 4 8,7 3)05 3,2 ++ - 7!, Т а б л ии а Э 801 сноб обфий ° Продолаительность рН лочная спота од- посл искод- после май ЯМБ . 7 ° 8 Г2С! 1/75! З)Э !2)3 2)8 2,95 +++ н 30 +++ - 30 11/75 13 3 !О 4 2 8 3 ! 1 Л11 7 ° 8 11/75 Т-96 7 8 13,3 12 3 2,8 2,95 +++ Т !20 Т»118 7,8 11/75 13 ° 3 104 28 3 ° 1 +++ 30 13,3 12)Э 2)8, 2,95 . +++ . ++ ЗО l 1/75 7 ° 8 Хонсорииуи 11/75 7,8 1Э ° 3 10)4 2)8 Э) +++ - 14 По достижении во всем объеме культиватора титра бактерий, равного 10 10 кг/мп, разводку используют для биологического кислотопонижения, рас- 5 качивая в емкости V 1250 дал с высококислотным суслом и виноматериалом в количестве 5Х к объему. Процесс, яблочно-молочного брожения ведут при 12-20 С, Результаты представлены 1О в табл,8. Виноматериалы, в которых прошло яблочно-молочное брожение при задаче консорциума молочнокислых бактерий Таировская= 1 ° имели выраженный сор то 1 5 вой аромат, были мягкими во вкусе и получили высокую дегустационную оценку) Формула изобретения Консорциум штаммов бактерий Leuconostoc olnos ВКПМ В-3365, используемый для кислотопонижения виноградного сусла и виноматериалов. )386656 Таблица4 7,4 4,б 8;б 3,4 8,4 3,4 9,б 4 б 10,б Твблмца5 6,8 6,9 12 6,8 1О +++ Т-118 . 25 6,8 3,5 +++ +++ 6,8.3,5 3,5 6е9 7,0.3,4 Т-120 25 10.18 3,4 7э) 2) 3,4 . +++ 7 ° 1 7,2 3,4 Т-96 +++ 3,4 14 7 ° 1 792 6,9 3,4 3,5 21 l0 Т-2С 14 3,5 3,5 6,9 6 9 +++ +++ 6,9 3,5 3,5 7,0 10! Титруемав кислотность исходи аи 1в Хонсор- 25 циам втанмов 18 9,8 2,85, 3,2 +++ 5,9 2 9 3,45 +е+ 14 2,8 2,8 +м б,О 2,95 3,45 +++ 15 2,75 2,75 +4+ б «2 2) 9 3,45 +4+ е++ 3,5 +++ 3,5 +++ 3 5 +++ 1386656 Таблица6 бщнй Вен азот, нмй иг/и азот, мг/л рН Ор ганиче с кислоты »» е» Исследуе объект »»» 4 » Исходное сусло 3,4 489 Виноматеряап t исходнмй 2 9 409 7,8 6,S 0,3 +н +++ 274 140 3,3 364 »»»»»» » » Исследуе объект » Исходное сусло 22 О 886 12 3 193 205 82 8,4 9.0 йвмоматериаи t исходный 19,8 80,0 l0,8 1 86 l9l 86 0 1! 2 7,9 15 ° 2 75,0 9,.5 70 180 80 1),5 8,3 после кяс ло топоиике и с по" ИЩЬЮ культурм T6Nровская) после кис" лотопо- няиении c аоионыч культурм Таи роаскаи" сли- Йи тру- Вяняал Лв ьио- еиан «испо» чя ста" кяс" та ки вя- лот- г/л ло ьный ность, г/ тен- г/л »аа »»Ю» 13,8 7,2 . 0,15 +++ +++ - 368 185! 3,2 . 7,0 0,2 +++ +++ - 336 !74 1386656 о о an an o o и an î eр g а о о о о а Ее ее ее е ° 1111 I !! 1.1 I . 1, I е в в ФЪ 4 1 ФЪ Ф а ° ФЪ И\ Ф an ° в ФЪ \ а © л л е ° е ь в ° а в и ° В th o Cl в в а е а о w» «е Ю л 4 ,! М М м В й Ф t4 ° ° 1 1 м ° ° 6ф 44 9Ь С4 t4 а а а в в ° а е . м ее Ф О Ю ф в 3 t» el Ю Ф л ° Ф о в И Ф Ф в о м ° е 4ф Я Щ(16 л С ) л СЧ л С Ъ л СЧ л Ф о 3+ о A о Da о и 00 л 00 л л л ь л 00 л О о л о ф1 л 1О л C) л л I kf о о л М о л СЧ о л e l! ) о ) l I ! о ! " l ! I Ф о ь л л л о л о лл о л о л fe A о и I. I l3 ) 0) 0) О g )4 te al(35 ою 1 с3 о 4 Й л 0) i 0)О) в Ж kf ) E IC ) Л ) а! ю ! 1 I I. ) Ю 1386656 3 л 3g о О л В З.В о е z u Й о el k ) 1 о ) Ф 2 I о ) E ) О, I и
