Способ получения протопластов мицелиальных грибов

 

Изобретение относится к биологии , а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки мицелиальных грибов для получения протопластов , ,и может быть использовано в биохимических, микробиологических и генетических исследованиях. С целью упрощения процесса и увеличения выхода протопластов в способе, включающем выращивание гриба на синтетической питательной среде и инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора в лизирующей системе, состоящей из ферментов микробного происхождения, в оптимальных условиях, инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора проводят в растворе ферментного препарата целлоконингина П1 ОХ в концентрации 50-100 мг/мл при температуре 20-28 С QO слабЬм встряхиванием в течение 5-6 чТ Пр.еимущество предложенного способа заключается в упрощении процесса и цолучении 100%-ного выхода протопластов за сравнительно короткий срок

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPbITI44 (2l) 4110984/3l-13 (22) 14.07.86 (46) !5.05.88 ° Бюл. )I- 18 (71) Институт биохимии им. А.Н. Баха и Всесоюзный научно-исследовательский йнститут биотехнологии (72) Л. С. Лагутина, О. П. Кожемякина и Л. С. Лосякова (53) 577.15(088.8)

j(56) Куликова А. К., Летунова Е. В. и Мартинович Л. И. Образование про.топластов и локализация ферментов в мицелии гриба Aspergillus clavatus.Прикл. биохимия и микробиология, 1985, XXI, 5, с. 587-591.

Загель М. Кобэева Н. Л. Получение протопластов и локализация рибонуклеазы Р -1,3-глюканазы и глюкоизомеразы в мицелии гриба Penicillium brevicompactum. - > Прикл..биохимия и микробиология, 1980, XV, 2, с. 245-248. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОППАСТОВ

МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ (51) 4 С 12 N 1/06 //(С 12 N 1/06, С 12 R 1:645) (57) Изобретение относится к биологии, а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки мицелиальных грибов для получения протопластов, и может быть использовано в биохимических, микробиологических и генетических исследованиях. С целью упрощения процесса и увеличения выхо да протопластов в способе, включающем выращивание гриба на синтетической питательной среде и инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора в лиэирующей системе, состоящей из фер1 ментов микробного происхождения, в оптимальных условиях, инкубацию мицелия в присутствии стабилизатора про- ф водят в растворе ферментного препарата целлоконингина П10Х в концентрации

50-100 мг/мл при температуре 20-28 С со слаб))м встряхиванием в течение 5-6 ч. С

Преимущество предложенного способа заключается в упрощении процесса и Я получении IOOX-ного выхода протопластов эа сравнительно короткий срок (5-6 ч).

1395665

Изобретение относится к биологии, а именно к способам ферментативного разрушения клеточной стенки мицелиальных грибов для получения прото5 пластов. Предлагаемый способ может быть использован в.биохимических, микробиологических и генетических исследованиях в частности для изучения внутриклеточных ферментов и 10 структур, локализации и секреции ферментов.

Цель изобретения — упрощение способа и увеличение выхода протопла1 стон. 15

Согласно предлагаемому способу получения протопластов иэ мицелиальных грибов, включающему выращивание гриба на синтетической питательной среде и инкубацию мицелия в присутствии 20 стабилизатора в лиэирующей системе, состоящей из ферментов микробного происхождения, в оптимальных условиях, инкубацию мицелия в присутствии ста билизатора проводят в растворе ферментного препарата целлоконингин

П10х в концентрации 50-100 мг/мп при о

20-28 С со встряхиванием н течение

5-6 ч.

Ферментный препарат целлоконингин, П10х содержит комплекс ферментов, включающий целлюлазу, ксиланазу, литические ферменты и др.

Способ осуществляют следующим образом.

В 0,2 M раствор фосфатного буфера рН 6,0-8,0 добавляют пеллоконингин

П10х в концентрации 50-100 мг/мл и стабилизатор. В полученную лизирующую систему помещают мицелий гриба в концентрации 80-120 мг/мл и инкубируют при 20-28 С в течение 5-6 ч при слабом встряхивании. При концен45 трации ферментного препарата меньшей о чем 50 мг/мл и температуре ниже 20 С не происходит полного превращения мицелия в протопласты, а при концентрации большей чем 100 мг/мл и темпеO ратуре выше 28 С происходит лизис ми- 0 целия без образования протопластов.

Концентрация мицелия и время инкубации не являются существенными отличительными признаками способа, так как процесс не зависит от концентрации мицелия, а его продолжительность определяется временем полного превращения клеток в протопласты.

Пример 1. 6 r свежевыращенного мицелия Asgergillus clavatus

1817 тщательно отмывают дистиллированной водой на воронке Бюхнера и один раз раствором 0,8М маннита в

0,2 М фосфатном буфере рН 6,2.

Полученный сырой мицелий помещают н лизирующую систему, которую готовят следующим способом.

3 r препарата целлоконингин П10х растворяют при перемешивании в течение 15 мин на магнитной мешалке в

60 мл 0,2 M фосфатного буфера рН 6,2 и нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием в течение 20 мин при 7 тыс.об/мин. К надосадочной жидкости добавляют маннит до конечной концентрации 0,8М, Суспенэию инкубио руют при 20 С в течение б ч при слабом встряхивании. По истечении этого срока под MHKpOcKQIIOM видно что практически все клетки мицелия превратились в протопласты, которые быстро в течение 2-3 мин претерпевают осмотический лиэис при добавлении воды— характерный признак протопластов.

Протопласты отделяют от среды центрифугированием при 4 тыс.об/мин,в тече" ние 10 мин и промывают раствором стабилизатора.

II р и м е р 2. Способ осущест" вляют согласно примеру 1, но используют ферментный препарат целлоконингин П10 Х в концентрации 100 мг/мл и инкубацию ведут в течение 5 ч при

20 С. В результате получают полное превращение клеток в протопласты.

Пример 3; По 200 мг свежевыращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок. В каждую пробирку добавляют по 2 мл отцентрифугированного раствора целлоконингина П10Х в концентрации 50 Mr/мп, содержащего

0,8М маннит. Первую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 40 С, вторую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 28 С. Результаты наблюдения в оптическом микроскопепоказывают, что в пробах, инкубированных при 40 С уже через 30 мин наблюдается полный лизис мицелия при полном отсутствии протопластов, В пробах, инкубированных при 28 С уже через 30 мин можно видеть, что удлиненные клетки мицелия превратились в круглые, а в поле зрения видны отдельные свободно плавающие протопла1395665

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет получать протопласты мицелиальных грибов с выходом lOOR при этом по сравнению с известным упрощается процесс получения протопластов за счет использования одного ферментного препарата вместо трех.

Формула и з обретения

Составитель В. Соина

Редактор М. Недолуженко Техред H. Верес Корректор А. Обручар

Заказ 2466/26

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-3$, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 сты. Процесс образования протопластов заканчивается через 17-20 ч.

Пример 4. По 200 мг свежевыращенного и отмытого мицелия помещают в 6 пробирок. В каждую пробу добавляют по 2 мл отцентрифугированного раствора ферментного препарата целлоконингина П10Х в концентрации

50 мг/мл содержащего 0,8М маннит.

Первую партию пробирок (3 повторноо сти) инкубируют при 28 С без встряхивания. Вторую партию пробирок (3 повторности) инкубируют при 28 С со слабым встряхиванием. Результаты наблюдения в оптическом микроскопе показали, что в пробах, инкубированных со встряхиванием, процесс образования протопластов заканчивается через 5-6 ч, т.е. в 3-4 раза быстрее, чем в пробах, инкубированных беэ встряхивания (17-20 ч).

После завершения процесса образования протопластов в среде выделения при наблюдении в микроскоп не видно остатков неизмененного мицелия. Полученные протопласты стабильны при выделении и хранении. Они не лизируют в процессе центрифугирования, а в растворе стабилизатора при 4 С сохраняются без изменения в течение недели. Лизат протопластов бып ис-. пользован для выделения мембранной фракции и мембранно-связанных ферментов. !

Способ получения протопластов мицелиальных грибов, предусматривающий выращивание грибов на синтетической питательной среде, инкубацию мицелия в буферном растворе, содержащем ферменты микробного происхождения и маннит в качестве стабилизатора про-. топластов, отличающийся

25 тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода протопластов, в качестве ферментов микробного происхождения используют препарат целлоконингин П10Х в концентрации 50—

100 мг/мл, при этом инкубацию ведут при встряхивании и температуре 20—

28 С в течение 5 — 6 ч.