Способ получения холестеролэстеразы

 

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается способа получения холестеролэстеразы из микроорганизмов, С целью повьшения активности целевого продукта и сокращения времени процесса продуцент холестеролэстеразы Pseudomo- nas mendocina ЦМПМ-В-2173 культивируют на оптимизированной питательной среде, в состав которой дополнительно введены семиводный сульфат магния, соевая мука, нитрат натрия и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л: глюкоза 0,5-3,0 нитрат HaTpiuj 1,0- 3,0; фосфат калия двузамещенный 0,5- 2,5; сульфат магния семиводный 0,5- 0,8; хлористый калий 0,3-0,8; соевая мука 20,0-40,OJ кукурузное масло 2,0- 8,0; вода - остальное Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в культуральной жидкости в 12 раз и сокращение времени культивирования продуцента в 2 раза по сравнению с известным способом 3 табЛо § 1(Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (111

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 4172588/31-13 (22) 17.10.86 (46) 15;05.88, Бюл. 11 18 (71) Институт биохимии АН ЛитССР и Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного (72) Л.Ю.Марцинкявичене, И.В,Бахматова, Г,-Г.P.Áðàæåíàñ, М,В.Песлякене,Е.А.Киприанова и О.И.Бойко (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 1151217, кл. С 12 0 9/16, 1980.

Авторское свидетельство СССР

У 966115, кл. С 12 М 9/15, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРОЛЭСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестеролэстеразы из микроорганизмов. С целью повышения активности целевого продук(59 4 C 12 N 9/16//(С 12 N 9/16, С 12 R 1:38) та и сокращения времени процесса продуцент холестеролэстеразы Pseudomonas mendocina ЦМПМ-В-2173 культивируют на оптимизированной питательной среде, в состав которой дополнительно введены семиводный сульфат магния, соевая мука, нитрат натрия и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л: глюкоза 0,5-3,0, нитрат натри (1 03,0; фосфат калия двузамещенный 0,52,5; сульфат магния семиводный 0,50,8; хлористый калий 0,3-0,8 соевая мука 20,0-40,0, кукурузное масло 2,08 0 вода — остальное. Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в культуральной жидкости в )2 раз и сокращение времени культивирования продуцента s 2 раза по сравнению с известным способом.

3 табл.

1395671 х

Холестерололеат +H O

Холестерин + Олеиновая кислота холестеролоксидаза

Холестерин +О Холес тенон Ф

+Н О

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения фермента холестеролэстеразы из микроорганизмов, который может быть использован в аналитических системах для диагностических целей в медицине.

Цель изобретения - повышение фер, ментативной активности холестеролэсте 10 разы в культуральной жидкости и сокращение времени культивирования, Сущность изобретения заключается в том, что культивирование микроорганизма Pseudomonas mendocina ЦМПМ 15 В- 2173 осуществляют на оптимизированf

Об активности холестеролэстеразы судят по скорости увеличения концентрации Н О . Электрохимическое окисление Н О на платиновом электроде при 0,6 В относительно Ag/AgC1 электрода сравнения генерируЕт анодный ток, Скорость увеличения анодного тока пропорциональна скорости образования Н О,,которая пропорциональна скорости гидролиэа холестерололеата, т,е. пропорциональна активности холестеролэстеразы. Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата и тем самым активность холестеролэстеразы.

Максимальная активность холесте- 40 ролэстеразы в среде культивирования достигается к 54-му ч роста и равна

135 ед/л. После осаждения сульфатом аммония активность полученного фермента-сырца составляет 900 ед/л.

Полученный таким образом препарат холестеролэстераэы сохраняет активо ность в течение 1-2 мес при +4 С.

Пример 1. Лабораторный способ получения холестеролэстеразы пу- 0 тем культивирования штамма РвеМошоnas mendocina ЦМПМ В-2173, Способ включает следующие этапы: поддерживание культуры в пробирках, приготовление посевного материала в пробирках, культивирование продуцента в колбах, осаждение холестеролэстеразы из культуральной жидкости, определение активности фермента. ной жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли, индуктор, в состав которой вводят в качестве источника азота — нитрат натрия, а в качестве индуктора — кукурузное масло и соевую муку.

Активность полученной холестеролэстеразы определяют электрохимическим методом,. включающим взаимодействие фермента с субстратом — хо- . лестерололеатом в фосфатном буфере в присутствии холестеролоксидазы.

Определение активности проводят в соответствии со следующей схемой последовательных реакций: ! олестеролэстераза ь

Поддерживание культуры P seudomo"

nas mendocina ЦМПМ В-2173 и приготовление посевного материала, .

Культуру поддерживают на столбиках 0,57-ного мясопептонного агара под 2-3 мл слоем стерильного вазелинового масла, В этих условиях продуцент при комнатной температуре может храниться без пересевов в течение нескольких лет. Для повседневной работы бактерии высевают из-под вазе" линового масла на столбики 0,57-ного мясопептонного агара, на которых культура без пересевов может хранить-,. ся при комнатной температуре до

1 мес. Для культивирования в колбах бактерии пересевают с рабочего столбика на скошенный мясопептонный агар, Культуру продуцента выращивают в термостате при 27 С в течение 24 ч, затем ее смывают с агара жидкой питательной средой, на которой в дальнейшем проводят культивирование. Полученная суспензия служит посевным материалом для выращивания продуцента холестеролэстеразы в колбах.

Продуцент культивируют в колбах на среде следующего состава, г/л:

Глюкоза 3,0

На 1" з 2,0

К НРО4 1,0 gS0„7H О 0,5

KCl 0 5

Соевая мука 20,0

Вода Остальное

1395671 где нА/минр

10—

1,2—

Получают

Кукурузное масло 4,0 рн 7,6

Для получения среды укаэанного состава отдельно готовят 6Х-ньй раствор глюкозы и 17.-ный раствор MgS04

»7H O. Эти растворы отдельно стерилизуют при 0,5 и 1,0 атм соответственно в течение 20 мин. Параллельно ro- 10 товят 900 мл раствора, содержащего остальные компоненты в указанных соотношениях. С помощью 1 н.раствора

NaOH доводят рН приготовленной среды до 7,6, которую разливают в колбы 15 емкостью 750 мл до 90 мп и стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин. Непосредственно перед засевом в каждую колбу стерильно добавляют по 5 мп раствора глюкозы и сернокислого маг- 20 ния. Засев проводят, добавляя в каждую колбу по 3 мл суспензии 24-часовой культуры Pseudomonas mendocina

ЦМПМ В-2173. Бактерии выращивают в условиях аэрации на круговой качалке 25 (200 об/мин) при 27 С в течение 5060 ч. Фильтрат полученной таким образом культураньной жидкости содержит холестеролэстеразу с активностью

135 ед/л, 30

Осаждение холестеролэстеразы иэ среды культивирования.

Культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при о

+5 С на центрифуге ЦВР-1 при 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадоч35 ную жидкость оставляют, а осадок удаляют. К надосядочной жидкости порциями при постоянном перемешивании и о температуре +4 С добавляют перекристаллизованный измельченный сульфат аммония до конечной концентрации

507. и оставляют стоять в холодильнио ке 1-2 ч при +5 С. Появившийся осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях, Надосадочную жидкость удаляют. Полученный осадок суспендируют в минимальном количестве 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,0, и проводят диализ против того же буфера в течение 20-24 ч, Определение активности холестеролэстеразы.

За единицу активности холестеролэстеразы принимают количество фермен- 55 ,та, катализирующее отщепление от холестерололеата 1 мкмоль холестерина в мин.

Для определения активности фермента применяют следующие растворы: фосфатный буфер 0,05 М, рН 7,0; субстрат — холестерололеат 0,1 М в 10Х-ном Triton х100; холестеролоксидаза — e активностью

17 ед/мп; азид натрия 0,1 М вЂ” для инактивации возможно присутствующей катализы; исследуемая проба, разбавленная до активности 150 ед/л.

В измерительную ячейку, содержащую 1 мл буферного раствора 1 вводят

0,05 мл раствора 2, 0,02 мл раствора

3, 0,02 мл раствора 4, Через 1-2 мин реакцию инициируют добавлением 0,1 мп раствора 5. Измеряют ток и проводят расчет активности по формуле ед/мл 2 „нА/мин .

1 2 ° ° 10

1000 изменение тока; степень разбавления исследуемой пробы; степень разбавления исследуемой пробы в ячейке; коэффициент, равный концентрации холестерина в мкМ, которая способствует изменению тока в ячейке на 1 нА /6/

1 2 ° 10 ° 8

А = - - — — — 9 4 0 9 ед/мп

Активность полученного препарата холестеролэстеразы равна 900 ед/л.

Пример 2. Определение зависимости активности холестеролэстеразы (ХЭ) от источника азота, концентрации глюкозы и минеральных со» лей, природы индуктора и его концентрации.

Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культуральной жидкости от источника азота за основу берут среду следующего состава, г/л: соевая мука 20; глюкоза

3»0» К НРО4 1,0; КС1 0,5; MgS04 7НО»

05 рН 7,6.

< I

Зависимость активности холестеролэстеразы от источника азота следующая:

1395671

Активность холестеролэстеразы, ед/л

Источник а90Та КНО

НаНО

32

12, "Н4НОэ, Мочевина ! !

1 таблица1

Т к нРО, tNRSO, 1н О KC1

Глокоза ЯаНО, )

Т Концентt рация, r/ë

Концент-, Актив" рация, ность г/л ХЭ, ед/л

Концент- Активрацня ность г/л 1 ХЭ, ед/л

Актив- Концент- Актив-! ность рация -ность, ХЭ, г/л ХЭ, I ед/л ea/n

Актив-, Концент, ность рация

ХЭ, гlл, ед/л

0,5

15 0 30 0,2

41 0,5 37 0,5

25 0,1 . 46

60 0,3 50

0,5

1,0

1,5

2,0

60 1,0

60 О,&

0,5 60

48 0,8 56

10 52

42 2 5 34 . 1 0

23 5,0 29

3,0

3,0

5 0

4,0

10,0

Продолжение табл.2

Оливковое масло,4 4

Подсолнечное масло, 4 4

4,0

4,0

Соевая мука,20 20

Соевая мука, 20+кукуруэ45

20+4

135

Т а б л и ц а 2

Соевая мука, 20+оливковое масло ив2.0+4

Индукт ть

Соевая мука, 20+подсолнечное масло

/л

20+4

Следй

Кукурузное масло,4

6,0

При всех указанных в таблице кон. центрациях глюкозы и минеральных со .лей обеспечивается активность полученной ХЭ в культуральной жидкости выпе, чем по прототипу (15-60 вместо 11 ед/л).

Для определения зависимости активности холестеролэстеразы от природы индуктора эа основу берут среду следующего состава, г/л: глюкоза

10,0 NaNÎ, 2,01 К ИРОЙ 1,0; КС1

0,5 М, MgSO< 7Н 0 0,5; рН 7,6, Полученные данные приведены в табл.2.

Наиболее эффективным источником азота является NANO>.

5 Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культуральной жидкости от концентрации глюкозы и минеральных солей эа основу берут среду следующего состава, г/л;

t0 соевая мука 20; глюкоза 3,0; НаНО

2 0 К НРО4 1,0 KCl О ° 5т MgS04 7НеО

Результаты приведены в табл,l.

Иэ таблицы видно,что более высокий положительный эдкЬект достигается при

55 использовании соевой муки в сочетании с кукурузным маслом (активность полученной ХЭ составляет 135 ед/л), 1395671 туральной жидкости в 12 раз и сокра-, щение времени культивирования продуцента Pseudomonas mendocina ЦИПМ

В-2173 в 2 раза по сравнению с известным способом.

Формула изобретения

Кукурузное масло

Соевая мука

Конце нт- Активрация ность г/л ХЭ, ед/л 20

Концент- Актив рация, ность г/Jt ХЭ, ед/л

5,0

0,8

10,0

82

135

20,0

54

30,0

40,0

0,3-0,8

20-40

Составитель Л.Борисова

Редактор Т.Лаэоренко Техред М.Ходаиич Корректор Н Король

Заказ 2468/27

Тираж 520

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Для определения зависимости активности холестеролэстеразы в культуральной жидкости от концентраций соевой муки и кукурузного масла эа ос5 нову берут среду следующего состава, r/a: соевая мука 20, глюкоза 3,0;

NaNO> 2,0, К НРО 1,0; НС1 0,5; NgSO<>

"7Н 0 0,5» рй 7,6 °

Данные установленной активности 10

ХЭ приведены в таблице 3.

Т а б л и ц а 3

Из таблицы видно, что оптимальными концентрациями соевой муки и кукурузного масла в среде культиви3S рования Pseudomonas mendocina ЦМПМ

В-2173 являются соевая мука 20-40 г/л, кукурузное масло 2-8 г/л.

Преимуществом предложенного способа является повышение активности получаемой холестеролэстеразы в куль.

Способ получения холестеролэстеразы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма

Pseudomonas mendocina КИПИ В-2173 на питательной среде при рН 7-7,6, содержащей глюкозу, двузамещенный фосфат калия, источник азота, ицдуктор и воду, до максимального накоп" ления фермента с последуницим осаждением фермента иэ культуральной жид кости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и сокращения време ни процесса, в питательную среду дополнительно вносят семиводный сульфат магния и хлористый калий, а в качестве источника азота используют нитрат натрия, в качестве иидуктора - соевую муку и кукурузное масло при следующем соотношении компонентов в питательной среде, г/л:

Глюкоза 0,5-3,0

Нитрат натрия 1,0-3,0

Двузамещенный фосфат калия: 0,5-2,5

Семиводный сульфат магния 0,5-0,8

Хлористый калий

Соевая -мука

Кукурузное масло 2-8

Вода Остальное