Способ диссоциации клеток гиппокампа

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения диссоциированных клеток животной ткани. Цель изобретения - удлинение срока переживания клеток в суспензии и улучшение электрофизических характеристик и хемочувствительности мембран. Сущность способа сводится к тому, что исходную ткань подвергают ферментативной обработке, используя комплекс протеаз грибного происхождения . Отмывку фермента, его инактивацию и механическую диссоциацию клеток осуществляют в модифицированном растворе Рингера. Срок переживания нейронов в суспензии до 6 ч. Порядок сохранившихся дендритов третий. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1, (19) (И) N 0

ВСРГОЮ 4 Я, 13, 13

ВйЪ ".".. .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTPM

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4019460/28-13 (22) 31. 01. 86 (46) 30. 01. 88. Бюл, К и (71) Институт физиологии им.А.А.Богомольцаа (72) Е.М, Ключко и А, Я, Цындренко (53) 578. 085. 23 (088. 8) (56) Кискин Н, И,, Цындренко А. Я, L-глутаматактивируемая проводимость в мембране изолированных пирамидных нейронов гиппокампа крысы. — Нейтрофизиология, 1985, 17, 1," 4, с,558-561 ° (54) СПОСОБ ДИССОЦИАЦИИ КЛЕТОК ГИППОKAKIA (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения диссоциированных клеток животной ткани, Цель изобретения — удлинение срока переживания клеток в суспенэии и улучшение электрофизических характеристик и хемочувствительности мембран. Сущность способа сводится к тому, что исходную ткань подвергают ферментативной обработке, используя комплекс протеаз грибного происхождения. Отмывку фермента, его инактивацию и механическую диссоциацию клеток осуществляют в модифицированном раст- ф воре Рингера, Срок переживания нейронов в суспенэии до 6 ч. Порядок сохранившихся дендритов третий.

С:

1 1370136 2

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения диссоциированных клеток животной ткани.

Цель изобретения — удлинение срока переживания клеток в суспензии и улучшение электрофизических характеристик и хемочувствительности мембран.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Пример. Крыс 2-3-недельного возраста декапитируют, извлекают гиппокамп, Гиппокамп переносят в раствор A следующего состава, ммоль:

NaC1 150; КС1 4; ПЕРЕВ 20; глюкоза

10 моль. В этом растворе ткань рассекают на поперечные срезы толщиной

200-300 мкм. Грезы инкубируют в растворе фермента. В качестве фермента для дальнейшей обработки исходной ткани используют комплекс щелочных протеаэ гриба Aspergillus oryzae амилориэин П20х, в концентрации О,!в

1,57. в солевом растворе Б следующего состава, ммоль: Na01 150; КС1 4;

NaHCO.3 26; глюкоза 10; концентрация свободного Са 0 — 1.10 моль задается

2+ концентрациями СаС1 0-1,8 ммоль и этиленгликольтетрауксусной кислотой (ЭГТА) 1,О ммоль, После растворения

HEPES pH исходного раствора доводят до 7,4 при помощи МаОН. При приготовлении исходного раствора ЭГТА

100 ммоль навеску ЭГТА растворяют в бидистиллированной воде, добавляя

NaOH до рН 7,4. Срезы гиппокампа переносят из раствора А в раствор Б с ферментом и обрабатывают при 36-37 С н течение 50-120 мин при постоянном пропускании через раствор карбогена (СО 2 57., О < 95/) Затем обрабатываемую ткань переносят в раствор Б беэ фермента (отмывочный) и выдерживают в нем в течение 20-120 мин, градуально повышая концентрацию в нем СаС1 до 0,5 — 2,6 ммоль, МВС1 от О до

1,1 ммоль, Сначала ткань выдерживают в растворе Б без фермента в течении

10-20 мин, а затем в этот раствор через равные промежутки времени добавляют растворы СаГ1, и МВС1, За

5-10 мин до конца процедуры в смесь добавляют 2-101 бычьей сыворотки.

Затем ткань подвергают мехаиической диссоциации в растворе А, в который добавляют О, .-2,6 ммоль СаС1

0,22-1,1 ммоль МрС1 . При помощи пастеровской пипетки ткань диссоциируют на отдельные клетки, которые переносят в среду МСИ (минимальная среда

Игла) с 2-107. бычьей сыворотки и фи5 эиологическими концентрациями СаС1

2 и МяС1 . В этой среде клетки находятся до 6 ч беэ заметных изменений своих морфологических и электрических характеристик. Часть срезов остается в отмывочном растворе при постоянном пропускании карбогена и температуре

20 С и может быть использована для получения изолированных клеток в течение 6-8 ч.

B отличие от нейронов, получаемых при осуществлении известного способа, нейроны, полученные по данному способу, обладают улучшенными морфологическими чертами: диаметр нейронов составляет 15-20 мкм, длина 2040 мкм, тела клеток полностью сохраняют характерную пирамидную форму и даже неровности поверхности, обуслов25 ленные контактами в ткани с соседними клетками, у них остается обширное дендритное древо, причем сохраняются дендриты вплоть до третьего порядка.

Клетки гораздо дольше переживают в суспензии без изменения своих характеристик. Тела клеток, полученных по известному способу, значительно более округлы, максимальный порядок сохранившихся дендритов второй. Срок переживания в суспенэии 2-3 ч.

Электро- и хемоуправляемые токи ионов через мембраны нейронов исследуют методом внутриклеточной перфузии в режиме фиксации потенциала на

4 мембране в сочетании с методом бысгрой смены внеклеточного раствора, Нейроны сохраняют электровозбудимость, Хемочувствительность их значительно улучшается. При сравнении амплитуд входящих натриевых токов в

45 ответ на аппликацию различных веществ у нейронов, полученных по предлагаемому и известному способам, видно, что амплитуды на порядок выше.Так,среднее значение максимальных амплитуд

50 при аппликации глутамата в 11,8 раэ выше (сравнивали 16 клеток, полученных по предлагаемому способу, и 16 по известному). Стабильность ответов сохраняется в течение 2 ч в

55 эксперименте.

Способ может быть использован для диссоциации любых нервных клеток, 1 3701

I з лкже клеток полже I äÎ÷ной Железы

1 почки, печени, соединительной ткани.

Составитель А.Ианыкин

Редактор М,Недолуженко Техред И.Дидык Корректор И. Эрдейи

Заказ 372/21 Тираж 520 Подписное

ННП!1ПИ Государственного комитета СССР

TI() делам изобретений и открытий

113035, 11осква, Ж-З5, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ диссоциации клеток гиппокампа путем ферментативнай обработки исходной ткани с последующими отмывкой и инактивацией фермента и механическим разделением клеток, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью удлинения срока переживания клеток в суспензии и улучшения электрофизиологических характеристик и хемочувст36 4 вительности мембран, ферментатинную обработку проводят амилоризином П20х при его концентрации 0,1 — 1,5Х н солевом растворе в присутствии следовых количеств СаС1, отмывку осуществляют в том же солевом растворе в условиях градуального повышения концентраций

СаС1 > и MgC1 до 0,5-2,6 ммоль и от

0 до 1,1 ммоль соответственно, а инактивацию и механическую диссоциацию осуществляют в присутствии тех же солей в концентрации 0,5-2,6 ммоль и 0,22-1,1 ммоль соответственно.