Штамм гибридных культивируемых клеток мыши мus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к урокиназе человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus, продуцирующего моноклрнальные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. Штамм UIG получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(n)35D и характеризуется следукнцими признаками. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с 10% змбриональной телячьей и 10% лошадиной сыворотки, посевная доза 10 кл. в 1 мл, кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дня, культура суспензионная. Штамм перевивается в виде асцита на мышах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците - 2-3 мг/мл. МЛ относятся к классу 1 G, t(K-5, имеют кон- S станту связьгоания с ант йгеном , ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы. I л СлЭ 00 4 а

СО)ОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ()9) (11) А1 (1) 4 С 12 N 5/00 А 6 f К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, ;:Ф

H ABTOPCHOIVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4091725/28-13 (22) 15.05.86 (46) 30.03.88. Бюл. В 12 (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР (72) Л.З.Якубов, Г.А.Кратасюк, В.В.Синицын, С.П.Домогатский, О.В.Рохлин и В.Н.Смирнов (53) 578.085.23(088.8) (56) Заявка РСТ N 86/01411 кл. А 61 К 39/395, 1986 ° (. 4) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ, Ю.".ТОК NNilH MUS MUSCULUS ИСПОЛЬЗУЕИЫ1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЬИ АНТИТЕЛ К УРОКИНАЗЕ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мьппи Nus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. Штамм

UIG получают гибридизацией спленоцитов мьппей линии Balb/с, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы Х63-А88.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)35Р и характеризуется следующими признаками.

Среда для культивирования — среда

RPNI-1640 с 10% эмбриональной телячьей и 10Х лошадиной сыворотки, посев5 ная доза 10 кл. в 1 мл, кратность рассева l:10 каждые 3-4 дня, культура суспензионная. Штамм перевивается в виде асцита на мышах линии Balb/с @ не менее 3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, С в зрелом асците — 2-3 мг/мл. MA относятся к классу Т (, (I@5 имеют кон- ф станту связывания с айтйгеном 10" М, ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы.

1384614

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента °

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии Вalb/с проводят 3 еже- 15 .нецельные подкожные инъекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь. Иммунизацию проводят смесью высоко- и низкомолекулярных форм фермента. Первая иммунизация осуществ- 20 ляется в полном адьюванте Фрейнда, вторая и третья — в неполном. Четвертую иммунизацию проводят внутрибрюшинно, введением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за 3 сут 25 до гибридизации. Гибридизацию проводят слиянием 10 клеток селезенки

7 иммунных мышей с 4 .10 клеток миеломы

Х63 — Ag 8.653 с помощью 50/-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 1500 усл. ед. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Для

5 культивирования и селекции гибридом используют среду RPMI-1640 с добавлением 10/ эмбриональной телячьей сыво-4 ротки, 10/ лошадиной сыворотки, 10 M гипоксантина, 4.10 М аминоптерина

5 и 1,6.10 М тимидина. Гибриды — продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку. После второго клонирования более 907 полученных субклонов иродуцируют антитела к урокиназе.

Продуктивные субклоны выводят в массовую культуру и обозначают UIG.

Штамм UIG хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института

Цитологии AH СССР под номером ВСКК(П)

35D и характеризуется следующими при- 50 знаками.

Культуральные признаки, Среда для культивирования — среда

RPMI-1640 с добавлением 10/ эмбриональной телячьей сыворотки, 107 лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина;

100 ед/мл пенициллина, 1 00 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия

0,05/ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5/ СО . Посевная доза 10 клеток в 1 мл, Клетки пассируют раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10.

Культура суспензионная.

Клетки штамма инъецируют в/брюшин7 но в количестве 10 кл в 1 мл среды.

Игла мышам линии Ва1Ъ/с, предварительно обработанных пристаном. Асцит образуется через 12-16 дней. Штамм перевивается на мышах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма, Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/

/мл культуральной среды, а в зрелом асците — 2-3 мг/мл асцитической жидкости, Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу ? Ь,(К), имеют константу связывания с урокиназой человека

ff —

10 M, ингибируют активность данного фермента, взаимодействуют с его двумя молекулярными формами.

Криоконсервирование клеток штамма.

2 10 клеток консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10/ диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ведут по следующей схеме: снижают о о температуру до 4 С, а затем по 1 С в мин до -40 С. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживают быстро при

37 С. Жизнеспособность клеток после о размораживания составляет 70-80Х.

Использование штамма ШС иллюстрируется следующими примерами. .Пример 1. Клетки штамма UIG помещают в пластиковый флакон объемом 75 см по 5" 10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с iOX эмбриональной телячьей сыворотки, 10Х лошадиной сыворотки, 4 мМ Е-глутамина, 100 ед/

/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05Х о меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере

57 СО . Клетки культивируют 4 дня.

Культуральную среду собирают, пентрифугируют в течение 10 мин при

1384b14

Культуральная среда штамма высокомолекулярная форма урокинаэы низкомолекулярная форма урокиназы

Неиммунные иммуноглобулины

5800i300

6000+300

Составитель М.Серова

Редактор Н,Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор И.Эрдейи

Заказ 1383/20 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная, 4

800 g. Супернатант тестируют на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высокомолекулярной либо низкомолекулярной урокиназы с концентрацией 10 мкг/

/мл вносят в ячейки полистиролового планшета для иммунологического анао лиза и инкубируют при 4 С в течение

12-15 ч. Затем планшет промывают

10 мМ фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 150 мМ 31аС1 и 0,05% Твин-20 (раствор А). В ячейки с сорбированной на полистироле урокиназой вносят по 100 мкл культуральной среды и инкубируют 1 ч. при комнатной температуре, после чего отмывают от несвязавшегося белка раствором А. Специфично свяэавшнеся антитела выявляют с помощью меченных радиоактивным 1

И (удельная активность 100000 имп/мин кмкг) кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, добавляя их по

2 мкг в лунку в 100 мкл раствора А.

В качестве отрицательного контроля 25 используют препарат неиммунных иммуноглобулинов мыши вместо культуральной среды штамма.

Радиоиммунологический анализ культуральной среды штамма UIG на присут- 30 ствие антител к урокиназе следующий.

Анализируемый Связалось антиобразец тел кролика против иммуноглобу.линов мыши, имп/

35 мьш и (20 мкг/

/мл) (контроль) 300 40

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности полученных NA npu взаимодействии их как с высоко- так и с низкомолекулярной формами урокиназы.

Пример 2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, наносят на колонку с иммобилизованными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мыши, колонку промывают раствором А (см. пример 1) и элюируют специфично связавшиеся антитела к урокиназе глициновым буфером рН 2,8. Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокинаэе, которые иммобилизуют на сефарозе 4В по стандартной методике с использованием бромциана. На 100 мкл иммуносорбента, содержащего 2 мг антител/мл геля, наносят 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и элюируют фермент глициновым буфером рН 2,8.

Анализ содержания фермента в элюате проводят на фибриновых пластинках, содержащих плазминоген. 100 мкл иммуносорбента с 90Х-ной эффективностью связывают в данных условиях всю урокиназу, содержащуюся в моче. Конечный выход фермента, очищенного в одну стадию, составляет не менее 60X., удельная активность препарата составляет 150000 МЕ/мг, что соответствует гомогенному препарату урокиназы.

Электрофорез показывает, что на иммуносорбенте выделяются и низкои высокомолекулярные формы урокинаэы. формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Мив шивси1цз BCKK(II)N35D, используемый для получения моноклональных антител к урокиназе человека.