Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к урокиназе человека

 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях . Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыгаи Miis mtisculus, продуцируюгчего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повьпченной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. .Штамм NG получают гибридизацией спленогштов мьпией линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8-653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 34Д и характеризуется следующими признаками. Среда для культивирования; среда RPMI-I640 с 10% эмбриональной телячьей и 10% лошадиной сыворотки, посевная доза 10 кл. в мл,кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дня, культура суспензионная . 1 1тамм перевивается в виде асцита на мыиах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците 2-3 мг/мл. МА относятся к классу IgG , (К),имеют константу связьшания с антигеном 10 М ,ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы. 1 табл. t (/ СО 00 ел 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН, SU„„1381158 А1

C l2N5/00A6I (51) 4 ч Ч

1

Е

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4069900/28-13 (22) 15.05.86 (46) 15.03.88.Бюл. М 1О (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (72) Л.З.Якубов, Г.А.Кратасюк, В.В.Синицын, С.П.Домогатский, О.В.Рохлин и В.Н ° Смирнов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Заявка PCT 11 86/01411, кл. А 61 К 39/395, 1986. (54) П!ТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК МЬШ1И MUS MUSCVLUS,ÈÑÏÎËÜÇÓÅМ1 П1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ MOHOKJIOHAJIbHbIX

АНТИТЕЛ К УРОКИНАЗЕ ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток MhlmH Мпя musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА 1 к урокиназе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. .Штамм "NG получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/с, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы

Х63-Ag8-653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР под номером BCKK(II) 34Д и характеризуется следующими признаками. Среда для культивирования: среда RPMI 1640 с

)07. эмбрионально" Tees be H IOX лошадиной сыворотки, посевная доза

1О кл. в мл,кратность рассева 1:IO каждые 3-4 дня, культура суспенэионная. Штамм перевивается в виде асцита на мьпчах линии Ва1Ь/с не менее

3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците 2-3 мг/мл. МА относятся к классу IgG,(К),имеют константу связывания с антигеном 10 М,ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы. 1 табл.

I 38! I 58

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть испольэовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях °

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА ) к урокинаэе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии Ва1Ъ/с проводят 3 еженедельные подкожные инъекции урокинаэы из расчета 30 мкг фермента на мышь. Иммунизацию проводят смесью высоко- и низкомолекулярных форм фермента, Первая иммунизация осуществляется в полном адъюванте Фрейнда, вторая и третья — в неполном.

Четвертую иммунизацию проводят внутрибрюшинно ннедением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе эа трое суток до гибридизации. Гибридиэуют 10 клеток селезенки иммунных мышей с 4 10 клеток миеломы Х63AR8.653 с помощью 50Х-ного раствора полиэтиленгликоля с мол.мас.1500.

После гибридизации клетки высевают в

96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду

RPMI-1640 с добавлением IОХ эмбриональной телячьей сыворотки, 107. лошадиной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4 -IO М аминоптерина и 1,6 10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку.

После второго клонирования более

907 полученных субклонов продуцируют антитела к урокинаэе.

Продуктивные клоны выводят в массовую культуру и обозначают UNG.

Штамм UNG хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии AH СССР под номером

ВСКК(П)34Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования — среда RPMI-1640 с добавлением 107 эмбриональной телячьей сыворотки,107 лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутами40

50 н 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10Х диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ведут по следующей схеме:

0 снижают температуру до 4 С, а затем по 1 С н 1 мин до -40 С. Клетки хранят н жидком азоте. Размораживают быстро при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-807..

Использование штамма UNG иллюстрируется следующими примерами °

Пример l ° Клетки штамма UNG помещают н пластиковый флакон объемом 75 см по 5 10 клеток н 5 мл

5 среды RPMI-1640 с 107 эмбриональной телячьей сыворотки,i07 лошадиной сывороткй, 4 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05Х меркаптозтанола при 37 С н атмосфена, IOO ед/мл пенициллина, 100 мкг/

/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05Х меркаптоэтанола при

О

37 С н атмосфере 57 СО . Посевная доза — IO клеток в 1 мл °

Х

Клетки пассируют раз н 3-4 дня.

Кратность рассена 1:10. Культура суспензионная. Клетки штамма инъециру7 ют в/брюшинно в количестве 10 кл в 1 мл среды Игла мышам линии Balb/с, предварительно обработанным пристаном. Асцит образуется через 1216 дней. )!!тамм перевивается на мы-!

5 шах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма.

Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на

4-й день культивирования составляет

20 20-30 мкг/мл культуральной среды, а н зрелом асците — 2-3 мг/мл асцитической жидкости.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашинании красителями на ДИК и тимидиноной метке н культуральной среде.

30 Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу Ig G,(Ê), имеют конс ганту связынания с антигеном 10 " М, ингибируют активность урокиназы человека, взаимодействуют с днумя ее молекулярными формами.

Криоконсервиронание.

2 -10 клеток штамма консернируют

138! 158 ловека.

Количество свяАнализируемый обэанных антител кролика, имп/мин раэец

Культуральная среда UNG высокомолекулярная форма урокиназы

5900 300 низкомолекулярная форма урокиназы

6000 300

llенммунные иммуноглобулины мыши /20 мкг/мл/

/контроль/

360+40

ВНИ!1. И Заказ 1164/27

Тираж 520 Подписное

Npo» s.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ре 57. СО> Клетки культивируют 4 дня.

Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800

Супернатант тестируют на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высоко- либо низкомолекулярной урокиназы с концентрацией 10 мкг/мл вносят в ячейки полистиролового планшета для иммунологического анализа и инкубируют

О при 4 С в течение 12-15 ч. Затем планшет промывают 10 м)! фосфагным буфером IрН 7,4 ), содержащим 150 м! NaCl и 0,05Х Твин-20 (раствор А ). В ячейки с сорбированной на полистироле урокиназой вносят по 100 мкл культуральной среды и инкубируют .

1 ч при комнатной температуре, после чего отмывают от несвяэавшегося белка раствором А. Специфично свяэавшиеся антитела выявляют с помощью

irt s меченных радиоактивным I (удельная активность 100000 имп/мин.мкг ) кроличьих антител против иммуногло- 25 булинов мышии, добавляя их по ? мкг в лунку в 100 мкл раствора А. В качестве отрицательного контроля используют препарат неиммунных иммуноглобулинов мыши вместо культуральной среды штамма.

Результаты радиоиммунологического анализа предс:авлены в таблице.

Результаты, представленные в таб лице, свидетельствуют о том, что полученные моноклональные антитела обладают высокой специфичностью по отношению как к высоко-, так и низко молекулярной формам урокиназы человека.

Пример 2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, наносят на колонку с иммобилизованными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мьш и, колонку промывают раствором А (cM ° пример 1 ) и элюируют специфично связавшиеся антитела к урокинаэе глициновым буфером (рН 2,8 ). Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокинаэе, которые иммобилизуют на сефароэе 4В по стандартной методике с использованием бромциана. На 100 мкл иммуносорбента, содержащего 2 мг антител/

/мл геля, наносят 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и элюируют фермент глициновым буфером (рН 2,8 ), Анализ содержания фермента в элюате проводят на фибриновых пластинках, содержащих плазминоген ° 100 мкл иммуносорбента с 907.— ной эффективностью связывают в данных условиях всю урокиназу, содержащуюся в моче. Конечный выход фермента, очищенного в одну стадию, составляет не менее 607, удельная активность препарата составляет !

50000 ME/ìã, что соответствует гомогенному препарату урокинаэы. Элект. рофорез показывает, что на икмуносорбенте выделяются низко- и высокомолекулярная формы урокиназы.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Штамм гибридных культивируемых клеток мьшiи Mus musculus BCKK/Ï/ N

34D, используемый для получения моноклональных антител к урокиназе че